脑溢血易感性无创检测试剂盒（agtr1等基因）的制作方法[0003]脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因位于8p22区,共编码475个氨基酸，是体内参与脂质代谢的一个关键酶，其主要功能是参与血浆乳糜微粒(CM)和低密度脂蛋白(LDL)中甘油三酯(TG)的分解，维持血脂的相对稳定。LPL基因存在数十种变异，Hind III酶切多态性是LPL常见变异之一。该多态性位于LPL的第8内含子，为近495位置上发生G代替T的突变，使Hind III酶切位点消失(T — G)，因而T和G等位基因又分别被称为H+和H-等位基因。林慧琼等人的研究发现，脑出血组H-等位基因分布频率较对照组多，可能引起H-基因型个体中TG及LDL的升高，导致脑溢血发生的危险性增加，提示脂蛋白脂酶H-等位基因可能是脑溢血发病的危险性因素。[0004]血管紧张素II受体-1(AGTRl)是G蛋白偶联受体，主要分布在血管平滑肌和心脏，被血管紧张素II激活后主要影响血压和水电解质平衡。AGTRl编码基因位于3q21_q25且只有单一拷贝，其编码区及非编码区存在着多处变异，与临床关系较为密切的变异是AGTRl基因3’端非编码区A1166C多态位点，该位点虽不影响基因的开放阅读框架，但可以参与转录和翻译的调控，从而影响机体内水钠平衡代谢、醛固酮的分泌和血管收缩等，而这些均是导致脑出血的关键因素。国内外研究发现，AGTRl 1166位的AC基因型个体患脑溢血的危险度明显高于AA基因型个体，显示C等位基因可能是脑溢血的易患基因。[0005]三磷酸腺苷结合盒转运子I (ABCAl)基因位于9q22_q31，其编码的ATP结合盒转运子 Al (ATP binding cassette transporter I, ABCA1)是一种整合膜蛋白，以 ATP 为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，后者结合到细胞表面的载脂蛋白，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)。由于ABCAl在胆固醇逆转运(RCT)和HDL形成的起始步骤中起重要作用，因此，ABCAl被认为是HDL代谢的限速因子。ABCAl第35外显子的5155位点存在G — A多态性，使第1587位精氨酸(R)变为赖氨酸(K)，即R1587K，该突变可导致体内HDL水平降低，血甘油三酯水平上升，增加了脑溢血的发病风险，显示ABCAl R1587K是脑溢血的一个遗传危险因素。[0006]鉴于LPL基因、AGTRl基因和ABCAl基因在脑溢血发病过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者的单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患脑溢血的高危人群，从而可采取有针对性的预防和治疗措施，这对于降低脑溢血的发病率有非常重要的意义。
[0007]基于AGTRl 基因上 A1166C (rs5186)、ABCA1 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL基因上Hind III (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估脑溢血发病风险级别，本发明提供一种脑溢血基因无创检测试剂盒。[0008]该试剂盒包括: 检测 AGTRl 基因上 A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上Hind III (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0010]PCR 产物纯化体系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0011]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0014]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0015]
实施例1.检测试剂盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0016]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:(1)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(2)ABCAl (Arg219Lys)正向引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA3’
ABCAl (Arg219Lys)反向引物:5’ ACTCACCAGGATTGGCTTCA3’
(3)LPL (Hind III)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (Hind III)反向引物:5’ CTTATGTTACTGGGCTTTCACC 3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml、DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0017]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)AGTRl(A1166C)测序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
(2)ABCAl (Arg219Lys)测序引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA 3’
(3)LPL (Hind III)测序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0020]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0021]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0022]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0023]实施例2.为人群进行预防脑溢血基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0024]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的AGTRl基因上A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上 Hind III (rs320)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。[0025]3.脑溢血高危人群风险评估分析 通过对受检者SNPs基因型的分析，出具脑溢血风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 AGTRl 基因上 Al 166C (rs5186)、ABCA1 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上Hind III (rs320)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读脑溢血基因无创检测报告单。