深静脉血栓易感性检测试剂盒（mthfr等基因）的制作方法[0002]深静脉血栓是血栓性疾病的一种，成为近年来严重威胁人类健康的医学问题之一。我国人群年发病率约为1/1000，且无性别和年龄差别，是骨折、大手术病人、肿瘤及其他慢性病患者的主要合并症。深静脉血栓的形成机制很复杂。随着分子生物学的发展，一些血栓易感基因成为研究热点，这其中包括内皮细胞蛋白C受体(endothelialprotein Creceptor, EPCR)、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetra-hydrofolatereductase, MTHFR)和血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)。[0003]EPCR是Fukudome等在1994年发现的蛋白C系统的一个新成员，主要表达于大血管的内皮细胞上。目前为止已发现EPCR存在多种基因突变或多态性。其中外显子4的多态性(A6936G)与深静脉血栓形成有很大关系。当EPCR基因6936位点上的碱基A突变成G后，导致EPCR蛋白跨膜区219位点由丝氨酸(Ser)变为甘氨酸(Gly)，而变异体中的这些残基将导致Gly-Gly配对，可能改变跨膜螺旋。基因突变的结果导致EPCR从细胞膜上脱落下来形成可溶性 EPCR (soluble endothelial cell protein C receptor, sEPCR)。sEPCR水平增高的与血栓形成患病率增高有关，是白种人静脉血栓形成的危险因素之一。[0004]MTHFR是同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶，能催化同型半胱氨酸转化成甲硫氨酸。MTHFR基因突变其代谢活性下降，从而导致血管舒缩因子平衡紊乱，形成深静脉血栓(特别是儿童)。MTHFR基因内存在着十多种多态性，最常见的则是C677T多态性。由于MTHFR基因677位点碱基C突变成 了 T，导致该位点的氨基酸由丙氨酸(Ala)突变成了缬氨酸(Val)，从而增加了一个新的限制性酶切位点。丙氨酸是MTHFR活性中心的重要氨基酸，其被缬氨酸替代则使酶的活性和耐热性都大大下降。该位点的3个基因型CC、CT和TT中TT的活性最低，约为CC基因型的45%。因此，MTHFR基因第677位点的TT基因型多态性与深静脉血栓形成有关。[0005]ACE是肾素-血管紧张素系统(renin-agiotensin system, RAS)中的关键酶,而RAS在维持机体纤溶平衡中具有重要的意义。ACE基因的16内含子处有一段287bp的插入/缺失(Ι/D)多态性。ACE基因Ι/D多态性与循环及组织ACE水平密切相关。经研究发现，具有ACE基因DD型的个体，其血浆ACE水平较高，而II型个体血浆ACE水平较低。与等位基因I相比，DD型个体静脉血栓形成危险显著增高。因此ACE基因Ι/D多态性与静脉血栓形成过程关系密切。[0006]综上所述，鉴于EPCR基因、MTHFR基因以及ACE基因在深静脉血栓形成中有着不可忽视的作用，可以通过疾病易感基因检测及时筛查出易患深静脉血栓的高危人群，从而有针对性的预防和治疗，这对于降低深静脉血栓的发病率有非常重要的意义。
[0007]基于EPCR 基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D(rs4646994)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估深静脉血栓发病风险级别，本发明提供一种深静脉血栓基因无创检测试剂盒。[0008]该试剂盒包括:
检测 EPCR 基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D(rs4646994)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0010]PCR 产物纯化体系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0011]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0014]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0015]实施例1.检测试剂盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0016]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(I)EPCR (A6936G)正向引物:5’AGACAAATGGATGGACCTG3’
EPCR (A6936G)反向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’ GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)ACE (Ι/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE (Ι/D)反向引物:5’ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml、DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0017]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul ;
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min, 72°C、20min。
[0018]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)EPCR (A6936G)测序引物:5’ AGACAAATGGATGGACCTG3’
(2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)ACE (Ι/D)测序引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul ；
在ABI2720型PCR扩增仪上进 行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的96 °C30s, 55°C 30s, 60°C 4min ；
反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。
[0019]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0020]实施例2.为人群进行预防深静脉血栓基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0021]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T(rsl801133)、ACE基因上I/D (rs4646994)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0022]3.深静脉血栓高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具深静脉血栓风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、ACE基因上I/D(rs4646994)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读深静脉血栓基因无创检测报告单。