扩张性心肌病易感性检测试剂盒（ctla4等基因）的制作方法[0002]扩张型心肌病(Dilatedcardiomyopathy, DCM)是最常见的心肌病，也是心力衰竭的主要病因之一。DCM是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征的心肌疾病，研究发现其发病机制主要与家族或遗传性有密切联系。其发病年龄为20~50岁，男性居多，在我国发病率为13/10万~84/10万左右，约20%的DCM患者有家族病史，5年存活率不到50%，预后很差。所以必须高度重视该病的危害，及早进行预防和治疗。[0003]DCM的发生是一个涉及多基因、多环节和多途径的过程。DCM的发生可能是众多致病因素共同作用的结果，目前科学家普遍认为遗传因素在DCM发病中起着至关重要的作用。[0004]国内外 研究证实，DCM发病机制与T细胞免疫应答有很大联系。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4, CTLA-4)基因有 3 个多态位点:启动子318位点C/T ;外显子I第17密码子49位点A/G ;外显子4的3’非翻译区642位点二核苷酸(AT) η微卫星。其中A49-G多态性与DCM发生有密切关系。研究发现，CTLA-4基因外显子A49-G多态性与DCM易感性相关，携带G等位基因者易患DCM，其机制可能为该多态性造成CTLA-4信号肽中编码苏氨酸和甘氨酸的替换，从而影响蛋白翻译后加工、修饰，使sCTLA-4功能发生变化。荷兰医学家研究同样表明，CTLA-4基因第一外显子第49位碱基多态性改变可导致蛋白前导肽链第17位苏氨酸与丙氨酸互换。同时他们研究证实，CTLA-4基因A49-G多态性中，等位基因G多与扩张性心肌病有关。[0005]CTLA-4基因第一肿瘤坏死因子(Tumor necrosis fator,TNF)是一种重要的细胞因子，主要分为TNF-α与TNF-β两种。TNF-a基因具有多态性，目前已经明确-308位点具有多态性，这主要是由第308位点碱基G变异为A导致的。有研究认为-308位点G-A的碱基变化可直接影响转录水平。Louis等人研究了基因-308位点多态性对转录的影响，发现A等位基因携带者的TNF- a产量比G等位基因纯合子高，认为308位点碱基突变影响了TNF-a的产量。Kroeger等人的研究发现TNF-a基因-308位点的A等位基因比G等位基因的转录活性高两倍。[0006]肿瘤坏死因子-β(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-β )基因第一内含子+252位点存在G/A多态性，可能与TNF的表达相关，并可能与DCM疾病的发生、发展相关。有研究表明，DCM患者TNF-β基因+252位点携带A等位基因频率明显高于正常人，提示该位点的多态性可能是DCM发生、发展的遗传因素。[0007]因此，建立简单、快速的DCM易感基因无创检测方法，能够检测出DCM发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出DCM的高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于降低DCM的发病率具有重要意义。[0008]


[0009]基于CTLA4 基因上 A49G(rs231775)、TNF-α 基因上 G-308A (rs 1800629)、TNF-β基因上A252G rs909253)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估扩张性心肌病发病风险级别，本发明提供一种扩张性心肌病基因无创检测试剂盒。
[0010]该试剂盒包括:
检测 CTLA4 基因上 A49G (rs231775)、TNF_ α 基因上 G-308A (rs 1800629)、TNF-β 基因上A252G rs909253)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0011]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
[0013]

[0014]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0015]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0016]
实施例1.检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0017]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(I)CTLA4 (A49G)正向引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’CTLA4 (A49G)反向引物:5’GAATACAGAGCCAGCCAAGC3’
(2 ) TNF- a (G-308A)正向引物:5’ GGAAGCCAAGACTGAAACCA3’
TNF- a (G-308A)反向引物:5’ TCATCTGGAGGAAGCGGTAG3’
(3 ) TNF- β (A252G)正向引物:5’ CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3’
TNF- β (A252G)反向引物:5’ TTCGTGCTTTGGACTACCG3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul。
[0018]反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0019]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul ;
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min, 72°C、20min。
[0020]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)CTLA4 (A49G)测序引物:5’ CTGAACACCGCTCCCATAAA3’
(2)TNF- a (G-308A)测序引物:5’ GGAAGCCAAGACTGAAACCA3’
(3)TNF-β (A252G)测序引物:5’ CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul ；
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的96°C30s, 55°C 30s, 60°C 4min ；
反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。
[0021]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0022]实施例2.为人群进行预防扩张性心肌病基因无创检测的服务。
[0023]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0024]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CTLA4基因上A49G (rs231775)、TNF-α 基因上 G-308A (rs 1800629)、TNF-β 基因上 A252G rs909253)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0025]3.扩张性心肌病高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具扩张性心肌病风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CTLA4基因上A49G、MTHFR基因上G-308A(G-308A)、SLC01B1基因上A252G(A252G)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检 者 详细说明和解读扩张性心肌病基因无创检测报告单。