一种新的多肽——人甘油3磷酸脱氢酶11和编码这种多肽的多核苷酸制作方法

脱氢 多肽 甘油 磷酸

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽--人甘油3磷酸脱氢酶11，以及编码此多肽的多核苷酸序列本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用生物体内血液及相关组织中的糖的含量均维持在一正常的水平，其含量的异常将导致人体各相关组织功能的异常而血糖含量的稳定受多种激素来共同调控，胰岛素即是促进体内合成代谢、调节血糖稳定的主要激素胰岛素在体内的分泌及其含量又受到一些相关的酶的调节作用，胰腺β细胞系中的线粒体甘油3磷酸脱氢酶即在生物体内调控着葡萄糖刺激的胰岛素分泌的过程该酶的作用异常将影响生物体内胰岛素的分泌异常，进而影响体内血糖含量的不稳定，即引发一系列与之相关的糖类代谢紊乱性疾病，如Ⅱ型糖尿病等[Ferrer J.,Aoki M.etal.,1996,Diabetes,45(2)262-266]人们已从多种不同的生物体内克隆得到多种不同来源的甘油3磷酸脱氢酶1998年，Gong等人又从鼠中克隆得到了一线粒体FAD相关的甘油3磷酸脱氢酶，该酶是甘油磷酸往返作用系统两种酶中的一种，在褐色脂肪组织的表达量较高，其蛋白序列中含有一FAD结合结构域该酶约由17个外显子组成，而其第一个外显子在不同启动子的转录表达下，有三种不同的转录本这三种不同的转录本决定了蛋白分别在不同组织中特异表达，外显子1A在脑中表达；外显子1B在各种组织中均有表达；而外显子1C主要在睾丸等组织中表达所有这些不同的转录本在体内的表达均受体内甲状腺激素的调控，其表达异常通常将导致生物体内血糖含量的异常，进而引发各种相关的代谢紊乱性疾病[Gong D.W.,Bi S.etal.,1998,DNA Cell Biol,17(3)301-309]1999年，Gudavol等人将糖尿病人的线粒体甘油3磷酸脱氢酶与正常人的线粒体甘油3磷酸脱氢酶进行比较、分析发现，该酶蛋白序列中的FAD结合结构域的缺失是导致Ⅱ型糖尿病发生的主要原因糖尿病人体内的线粒体甘油3磷酸脱氢酶的第18个碱基位点，均由T替代了A；且其内含子的第26位缺失了六个碱基TTTTAA；该位点即是蛋白与FAD的结合位点该位点的突变直接影响了酶在体内的作用活性，进而影响与之相关的胰岛素在体内的分泌及体内血糖的正常含量，从而导致了体内相关的代谢紊乱性疾病的发生[Gudavol M.,Vidal-TaboadaJ.M.et al.,1999,Biochem Biophys Res Commun,263(2)439-445]由上可知，线粒体甘油3磷酸脱氢酶在生物体内相关的代谢途径中起着极为重要的调控作用该酶在生物体内调控着葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程，而胰岛素是生物体促进合成代谢、调节血糖稳定的主要激素，其分泌异常将导致体内血糖含量的异常，进而引发相关的代谢紊乱性疾病由此可知，该酶在生物体内与一些糖类代谢紊乱性疾病如Ⅱ型糖尿病等、与之相关的各种肿瘤及癌症等的发生密切相关该蛋白还可用于诊断及治疗上述各种相关的疾病通过基因芯片的分析发现，在胸腺、睾丸、肌肉、脾脏、肺、皮肤、甲状腺、肝、PMA+的Ecv304细胞株、PMA-的Ecv304细胞株、未饥饿的L02细胞株、砷刺激1小时的L02细胞株、砷刺激6小时的L02细胞株前列腺、心、肺癌、胎膀胱、胎小肠、胎大肠、胎胸腺、胎肌、胎肝、胎肾、胎脾、胎脑、胎肺以及胎心中，本发明的多肽的表达谱与人甘油3磷酸脱氢酶的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似本发明被命名为人甘油3磷酸脱氢酶11由于如上所述人甘油3磷酸脱氢酶11蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的人甘油3磷酸脱氢酶11蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列新人甘油3磷酸脱氢酶11蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础这种蛋白可能构成开发疾1病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的本发明的一个目的是提供分离的新的多肽--人甘油3磷酸脱氢酶11以及其片段、类似物和衍生物本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸本发明的另一个目的是提供含有编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸的重组载体本发明的另一个目的是提供含有编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸的基因工程化宿主细胞本发明的另一个目的是提供生产人甘油3磷酸脱氢酶11的方法本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽--人甘油3磷酸脱氢酶11的抗体本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽--人甘油3磷酸脱氢酶11的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂本发明的另一个目的是提供诊断治疗与人甘油3磷酸脱氢酶11异常相关的疾病的方法本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是人源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％相同性的多核苷酸更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中137-445位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-1836位的序列本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体本发明还涉及一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制人甘油3磷酸脱氢酶11蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽本发明还涉及用该方法获得的化合物本发明还涉及一种体外检测与人甘油3磷酸脱氢酶11蛋白异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性本发明也涉及一种药物组合物，它含有本发明多肽或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体本发明还涉及本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于治疗Ⅱ型糖尿病、糖尿病并发症、及其它类型糖尿病或其它由于人甘油3磷酸脱氢酶11表达异常所引起疾病的药物的用途本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力“激动剂”是指当与人甘油3磷酸脱氢酶11结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合人甘油3磷酸脱氢酶11的分子“拮抗剂”或“抑制物”是指当与人甘油3磷酸脱氢酶11结合时，一种可封闭或调节人甘油3磷酸脱氢酶11的生物学活性或免疫学活性的分子拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合人甘油3磷酸脱氢酶11的分子“调节”是指人甘油3磷酸脱氢酶11的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及人甘油3磷酸脱氢酶11的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变“基本上纯”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人甘油3磷酸脱氢酶11基本上纯的人甘油3磷酸脱氢酶11在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带人甘油3磷酸脱氢酶11多肽的纯度可用氨基酸序列分析“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergenesoftware package,DNASTAR,Inc.,Madison Wis.)MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇然后将各簇以成对或成组分配两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算序列A与序列B之间匹配的残基个数 100序列A的残基数-序列A中间隔残基数-序列B中间隔残基数也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.,(1990)Methods in emzumology 183625-645)“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合人甘油3磷酸脱氢酶11的抗原决定簇“人源化抗体”是指非抗原结合区域的氨基酸序列被替换变得与人抗体更为相似，但仍保留原始结合活性的抗体“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的如本文所用，“分离的人甘油3磷酸脱氢酶11”是指人甘油3磷酸脱氢酶11基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人甘油3磷酸脱氢酶11基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带人甘油3磷酸脱氢酶11多肽的纯度能用氨基酸序列分析本发明提供了一种新的多肽--人甘油3磷酸脱氢酶11，其基本上是由SEQ IDNO2所示的氨基酸序列组成的本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基本发明还包括人甘油3磷酸脱氢酶11的片段、衍生物和类似物如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的人甘油3磷酸脱氢酶11相同的生物学功能或活性的多肽本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(Ⅰ)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(Ⅱ)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(Ⅲ)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(Ⅳ)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、00衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的它包含的多核苷酸序列全长为1836个碱基，其开放读框137-445编码了102个氨基酸根据基因芯片表达谱比较发现，此多肽与人甘油3磷酸脱氢酶有相似的表达谱，可推断出该人甘油3磷酸脱氢酶11具有人甘油3磷酸脱氢酶相似的功能本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNADNA可以是单链的或是双链的DNA可以是编码链或非编码链编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质本发明的编码人甘油3磷酸脱氢酶11的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法更经常选用的方法是cDNA序列的分离分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定人甘油3磷酸脱氢酶11的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物上述方法可单用，也可多种方法联合应用在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等在第(4)种方法中，检测人甘油3磷酸脱氢酶11基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,745463-5467)测定这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用人甘油3磷酸脱氢酶11编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法本发明中，编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.2633521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码人甘油3磷酸脱氢酶11的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,aLaboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因本发明中，编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知可供选择的是用MgCl2如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人甘油3磷酸脱氢酶11(Science,1984；2241431)一般来说有以下步骤(1)．用本发明的编码人人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)．在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)．从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基在适于宿主细胞生长的条件下进行培养当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白这些方法是本领域技术人员所熟知的这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、肾上腺缺乏症、皮肤病、各类炎症、HIV感染和免疫性疾病等人体内血液及相关组织中的糖的含量应维持在一正常的水平，其含量的异常将导致人体各相关组织功能的异常而血糖含量的稳定受多种激素如胰岛素、甲状腺激素等共同调控其中胰岛素是促进体内合成代谢、调节血糖稳定的主要激素胰岛素在体内的分泌及其含量又受到一些相关的酶的调节作用，胰腺β细胞系中的线粒体甘油3磷酸脱氢酶即在体内调控着葡萄糖刺激的胰岛素分泌的过程该酶的作用异常将影响体内胰岛素的分泌异常，进而影响体内血糖含量的不稳定，即引发一系列与之相关的糖类代谢紊乱性疾病，如Ⅱ型糖尿病等甘油3磷酸脱氢酶基因序列具有多个外显子，其外显子在不同启动子的转录表达下有不同的转录本这些不同的转录本在体内的表达均受体内甲状腺激素的调控，其表达异常通常将导致生物体内血糖含量的异常，进而引发各种相关的代谢紊乱性疾病研究发现，糖尿病人的线粒体甘油3磷酸脱氢酶蛋白序列中的FAD结合结构域的缺失直接影响了酶在体内的作用活性，进而影响与之相关的胰岛素在体内的分泌及体内血糖的正常含量，是导致Ⅱ型糖尿病发生的主要原因由上可知，线粒体甘油3磷酸脱氢酶在生物体内相关的代谢途径中起着极为重要的调控作用该酶在体内调控着葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程，而胰岛素是生物体促进合成代谢、调节血糖稳定的主要激素，其分泌异常将导致体内血糖含量的异常，进而引发相关的代谢紊乱性疾病由此可知，该酶在生物体内与一些糖类代谢紊乱性疾病如Ⅱ型糖尿病等、与之相关的各种肿瘤及癌症等的发生密切相关该蛋白还可用于诊断及治疗上述各种相关的疾病本发明的多肽的表达谱与人线粒体甘油3磷酸脱氢酶的表达谱相一致，两者具有相似的生物学功能它在体内调控着葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程，进而调节机体的血糖稳定，其表达异常直接影响了人线粒体甘油3磷酸脱氢酶在体内的作用活性，进而影响与之相关的胰岛素在体内的分泌及体内血糖的正常含量，并产生相关的疾病由此可见，本发明的人甘油3磷酸脱氢酶11的表达异常将产生各种疾病尤其是Ⅱ型糖尿病、糖尿病并发症、及其它类型糖尿病，这些疾病包括但不限于非肥胖型非胰岛素依赖型糖尿病，肥胖型非胰岛素依赖型糖尿病，Ⅰ型糖尿病，葡萄糖耐量减低，妊娠期糖尿病，酮症酸中毒，糖尿病性心脏病，糖尿病性心血管病变，糖尿病性肾病变，糖尿病性眼病变，糖尿病性神经病变，糖尿病性皮肤、肌肉、关节病变本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗各种疾病尤其是Ⅱ型糖尿病、糖尿病并发症、及其它类型糖尿病等本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人甘油3磷酸脱氢酶11的药剂的方法激动剂提高人甘油3磷酸脱氢酶11刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人甘油3磷酸脱氢酶11的膜制剂与标记的人甘油3磷酸脱氢酶11一起培养然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力人甘油3磷酸脱氢酶11的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等人甘油3磷酸脱氢酶11的拮抗剂可以与人甘油3磷酸脱氢酶11结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人甘油3磷酸脱氢酶11加入生物分析测定中，通过测定化合物对人甘油3磷酸脱氢酶11和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物能与人甘油3磷酸脱氢酶11结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得筛选时，一般应对人甘油3磷酸脱氢酶11分子进行标记本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体本发明还提供了针对人甘油3磷酸脱氢酶11抗原决定簇的抗体这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段多克隆抗体的生产可用人甘油3磷酸脱氢酶11直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等制备人甘油3磷酸脱氢酶11的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler and Milstein.Nature,1975,256495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,816851)而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人甘油3磷酸脱氢酶11的单链抗体抗人甘油3磷酸脱氢酶11的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人甘油3磷酸脱氢酶11与人甘油3磷酸脱氢酶11结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素如人甘油3磷酸脱氢酶11高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人甘油3磷酸脱氢酶11阳性的细胞本发明中的抗体可用于治疗或预防与人甘油3磷酸脱氢酶11相关的疾病给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人甘油3磷酸脱氢酶11的产生或活性本发明还涉及定量和定位检测人甘油3磷酸脱氢酶11水平的诊断试验方法这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定试验中所检测的人甘油3磷酸脱氢酶11水平，可以用作解释人甘油3磷酸脱氢酶11在各种疾病中的重要性和用于诊断人甘油3磷酸脱氢酶11起作用的疾病本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸也可用于多种治疗目的基因治疗技术可用于治疗由于人甘油3磷酸脱氢酶11的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的人甘油3磷酸脱氢酶11，以抑制内源性的人甘油3磷酸脱氢酶11活性例如，一种变异的人甘油3磷酸脱氢酶11可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人甘油3磷酸脱氢酶11，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性因此重组的基因治疗载体可用于治疗人甘油3磷酸脱氢酶11表达或活性异常所致的疾病来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸转移至细胞内构建携带编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)另外重组编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等抑制人甘油3磷酸脱氢酶11mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸可用于与人甘油3磷酸脱氢酶11的相关疾病的诊断编码人甘油3磷酸脱氢酶11的多核苷酸可用于检测人甘油3磷酸脱氢酶11的表达与否或在疾病状态下人甘油3磷酸脱氢酶11的异常表达如编码人甘油3磷酸脱氢酶11的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断人甘油3磷酸脱氢酶11的表达状况杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断用人甘油3磷酸脱氢酶11特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人甘油3磷酸脱氢酶11的转录产物检测人甘油3磷酸脱氢酶11基因的突变也可用于诊断人甘油3磷酸脱氢酶11相关的疾病人甘油3磷酸脱氢酶11突变的形式包括与正常野生型人甘油3磷酸脱氢酶11DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联这些数据可见于例如，V.Mckusick,MendelianInheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂这些组合物可以作为药物用于疾病治疗本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径人甘油3磷酸脱氢酶11以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药施用于患者的人甘油3磷酸脱氢酶11的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围