专利名称：一种水稻稻瘟病抗性基因RMg4或RMg5或RMg6及其应用的制作方法由于植物病害每年给农、林生产带来巨大的损失，合理有效地防治植物病害是保障农、林可持续发展所必须解决的关键问题之一。大量实践证明，开发和利用已有的植物抗病种质资源是防治植物病害的最为有效的方法之一(Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)。传统的抗病品种培育，通常是将优质高产的品种与抗病性强的材料杂交，然后通过不断的回交选育，最后得到抗病且优质的新品种。尽管这一方法十分有效，但极其耗时，当新品种培育出来之后，可能对病原囷新进化广生的株系或小种表现为感病(Tanksley etal. 2007);经典的图位克隆方法利用抗病和感病的品种杂交，然后对大量的分离后代接种病菌、鉴定抗性、遗传作图等，最后在精确遗传定位的基础上进行克隆。这种方法取得了很好的效果，在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用(如抗白叶枯病基因Xa21的分离和利用，Song et al. 1995)，但因其周期长、费时费力、分离和等位性检测较难等原因，不适合大量克隆抗病基因的需要。同时，因抗病基因独特的遗传方式，也使该方法的应用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因为例，该类基因在基因组中通常成簇(genecluster)分布(Wang et al. 1999;Liu et al. 2002; Lin et al. 2007),在不同品种的同源染色体间的位置和结构也多呈不对称分布，等位关系不明确，拷贝数变异大(Yang etal. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。这些遗传现象，大大增加了图位克隆的难度，严重影响了抗病基因的克隆效率。近年来，随着植物抗病及抗病相关基因分子水平研究的突破性的进展，使我们对植物抗病及抗病相关基因的结构、功能、起源、变异及保存的认识有了根本性的变化。即植物抗病基因，主要是一类含有LRR结构域的基因，其中又以NBS-LRR (核酸结合-富含亮氨酸)类型抗病基因为主。由于这些基因在结构与功能上都具有高度的相似性，结合其独特的遗传与进化特征，为快速的克隆与鉴定这些基因提供了便利，也为高效地利用抗病种质资源提供了新的机遇。到目前为止，已经超过50个植物抗病基因从不同的植物中得以克隆和分离，其中主要类型的抗病基因为NBS-LRR结构类型(Nucleotide-binding site andleucine-rich-repeat,即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复蛋白)的抗病基因；另外还有少部分抗病基因主要为eLRR-TM-pkinase、eLRR-TM、STK等类型。这些抗病基因分别编码对病毒、细菌、真菌、卵菌、甚至线虫和昆虫等的抗性蛋白。水稻iOryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是我国最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到严重的病虫害的侵扰，给农业生产带来了巨大的损失。其中，稻瘟病是分布最广、 危害水稻最严重的病害之一，严重影响到水稻的产量，全球每年由稻痕病引起的水稻产量损失占11-30% (约合1. 57亿美元,http://www. fungalgenomics.ncsu. edu)，直接威胁到稻农增收和国家的粮食安全。无论在世界还是在我国，解决稻瘟病难题一直也是保障水稻持续生产的一个优先研究的课题。稻瘟病防治的最大困难之一是病菌本身变异与分化速度快(凌忠专等，2004)。新的稻痕病菌生理小种层出不穷，已有的抗病基因(Plant disease resistance, R基因)很快丧失抗性，而寻找新的抗病材料越来越难，水稻稻痕病对水稻生产的威胁也越来越大。对应易变的病原菌，水稻必须拥有很多抗病基因。从已经定位的70-80个基因位点来看，水稻抗稻瘟病基因数量众多。但是，到目前为止已经克隆的抗稻瘟病基因仅11个。虽然已经定位的基因可以通过分子标记辅助选择的方法加以利用，这一选育过程繁琐、耗时，当新品种培育出来之后，可能对新产生的变异菌株表现为感病，克隆并直接转化抗病基因可能是最直接有效的培育抗病品种的途径。在这样的背景下，使用新的思路，研究开发出新技术，就显得尤为重要并且具有难以估量的价值。本发明充分利用植物抗病基因结构上的相似性及独特的遗传变异与进化特征，通过一种高效、快速的植物抗病基因的克隆方法分离、获得水稻稻痕病抗性基因。
本发明的目的是，分离克隆水稻高抗品种中携带的稻瘟病抗性基因RMg4，RMg5和RMg6及包含调控这三个基因的启 动子的DNA片段。本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因RMg4，RMg5和RMg6所编码的蛋白质序列。本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。本发明涉及克隆和鉴定一种包含RMg4，RMg5和RMg6基因的DNA片段，这些基因编码的蛋白能使水稻对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。其中，所述片段分别如序列表SEQ ID NO:1，SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 7所示或者基本上相当于SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID N0:1, SEQ IDN0:4或SEQ ID N0:7所示序列的亚片段。这些DNA序列都编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:8所示。所分离、克隆的RMg4，RMg5和RMg6抗性基因编码NBS-LRR蛋白。他们的蛋白都包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，RMg4蛋白的C-末端为26个LRR重复，RMg5蛋白的N端为明显的CC结构域，C端为25个LRR重复，RMg6蛋白的N端也为明显的CC结构域，C端为27个LRR重复。根据本发明提供的RMg4，RMg5和RMg6基因序列信息(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4或SEQ ID N0:7)，本领域技术人员可以通过以下方法获得与RMgl和RMg2等同的基因(I)通过数据库检索获得；(2)以RMg4，RMg5和RMg6基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据RMg4，RMg5和RMg6基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在RMg4，RMg5和RMg6基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。本发明提供的稻瘟病抗性基因RMg4，RMg5和RMg6具有重要的应用价值。将所述的RMg4，RMg5和RMg6基因序列用任何一种转化方法导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽抗谱或增强抗性。本发明具有如下有益效果将克隆的抗稻瘟病基因转入感病的植物中，有助于获得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用，从而能够克服传统抗病育种中远缘杂交的困难。此外，可以用转基因技术在植物中累加多个抗病基因，缩短育种周期。本发明还能够进一步提供或应用上述DNA片段获得的抗病转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他植株。图1为本发明流程不意图。图1A :抗稻痕病候选位点的确定；图1B-E :抗稻痕病基因的分离与克隆；图1F-G :抗稻瘟病基因的遗传转化；图1H :转化体的鉴定。
图2为实施例一中稻瘟病抗性基因RMg4的转化体的CaMV35S启动子和潮霉素抗性基因的PCR检测电泳图；图1A为CaMV35S启动子的PCR扩增产物，泳道1_6为转化体的PCR扩增产物，泳道7为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物；图1B为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1_6为转化体的PCR扩增产物，泳道7为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物。图3为实施例一中植株抗性鉴定图。图3A :对照植株新2号的抗性鉴定图；图3B :稻瘟病抗性基因RMg4的转化植株的抗性鉴定图。图4为实施例二中稻瘟病抗性基因RMg5的转化体的CaMV35S启动子和潮霉素抗性基因的PCR检测电泳图；图4A为CaMV35S启动子的PCR扩增产物，泳道1_5和7为转化体的PCR扩增产物，泳道6为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物；图4B为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1_5和7为转化体的PCR扩增产物，泳道6为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物。图5为实施例二中植株抗性鉴定图。图5A :对照植株新2号的抗性鉴定图；图5B :稻瘟病抗性基因RMg5的转化植株的抗性鉴定图。图6为实施例三中稻瘟病抗性基因RMg6的转化体的CaMV35S启动子和潮霉素抗性基因的PCR检测电泳图；图6A为CaMV35S启动子的PCR扩增产物，泳道1_2及4_7为转化体的PCR扩增产物，泳道3为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物；图6B为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1_2及4-7为转化体的PCR扩增产物，泳道3为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物，泳道8为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物。图7为实施例三中植株抗性鉴定图。图7A :对照植株新2号的抗性鉴定图；图7B :稻瘟病抗性基因RMg6的转化植株的抗性鉴定图。

1、抗稻瘟病候选位点RMg4的确定(1)多以基因家族和基因簇的形式存在，在日本晴和93-11中各有2个相近的拷贝；(2)在其LRR区域，特别是xxLxLxx区域具有较高的Ka/Ks值；
2、稻瘟病抗性基因RMg4的分离与克隆利用公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)和93_11为参考序列，设计引物(引物两端皆带有酶切位点AscI)。引物序列参加序列表，正向引物序列正向引物序列如SEQ ID NO: 10所示；反向引物序列如SEQ IDNO: 11所示。以抗病水稻品种Tet印，谷梅2号和Q2436为模板，利用长片段PCR技术(Long-PCR)扩增候选基因片段。PCR程序如下95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，60°C复性45秒，68°C延伸8分钟，共35个循环，随后72°C保温10分钟，最后10°C恒温。随后对PCR产物进行割胶回收。

3、双功能基础载体的准备将稀有酶切位点AscI导入双功能载体pCAMBIA1300的多克隆位点BamHI和SalI之间，取代酶切位点XbaI，构成基础载体pCAMBIA1300-AscI。4、候选抗性基因与基础载体的连接用限制性内切酶AscI，同时酶切PCR产物与基础载体质粒，并纯化。在T4连接酶的作用下，将候选基因片段连入基础载体pCAMBIA1300-AscI。5、候选抗性基因的遗传转化将携有候选基因的双功能载体导入根癌农杆菌EHA105，采用农杆菌介导法，将候选基因转化到水稻普感品种新2号，TP309和Co39中。最后一共获得20株独立的转化体。6、PCR分子检测以转化体DNA为模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S启动子的特异性引物对其进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 16 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 17。CaMV35S启动子的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 18 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 19。7、转化体的抗性鉴定选择10个来源地不同，区别力好的独立稻瘟病菌生理小种作为检测的病原菌种。利用稻瘟病菌小种接种感染T2代转基因植株和对照品种，筛选抗病性改变的转化体。抗性鉴定结果显示候选基因RMg4在普感品种新2号的遗传背景下，对5个病原菌株都显示不同程度抗性，表明候选基因RMg4具有特异性抗性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg4的基因结构和蛋白结构分析采用步移法对RMg4的DNA序列进行了测序。RMg4基因DNA长度为4150bp，含有3个开放读码框，2个内含子和3个外显子。RMg4编码的蛋白序列如SEQ ID N0:2所示。RMg4基因编码I个由1132个氨基酸残基组成的蛋白多肽。RMg4蛋白属于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端为26个LRR重复。实施例二 稻瘟病抗性基因RMg5 (0s08g07390-Q2436)的克隆及鉴定
1、抗稻瘟病候选位点RMg5的确定(1)以单基因形式存在，在日本晴和93-11中各有一个拷贝；(2)在其LRR区域，特别是xxLxLxx区域具有较高的Ka/Ks值；
2、稻瘟病抗性基因RMg5的分离与克隆利用公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)和93-11为参考序列，设计引物(引物两端皆带有酶切位点AscI)。引物序列参见序列表，正向引物序列为SEQ ID NO: 12所示；反向引物序列为SEQ ID NO: 13。以抗病水稻品种Tet印，谷梅2号和Q2436为模板，利用长片段PCR技术(Long-PCR)扩增候选基因片段。PCR程序如下95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，60°C复性45秒，68°C延伸9分钟，共35个循环，随后72°C保温10分钟，最后10°C恒温。随后对PCR产物进行割胶回收。3、双功能基础载体的准备将稀有酶切位点AscI导入双功能载体pCAMBIA1300的多克隆位点BamHI和SalI之间，取代酶切位点XbaI，构成基础载体pCAMBIA1300-AscI。4、候选抗性基因与基础载体的连接用限制性内切酶AscI，同时酶切PCR产物与基础载体质粒，并纯化。在T4连接酶的作用下，将候选基因片段连入基础载体pCAMBIA1300-AscI。5、候选抗性基因 的遗传转化将携有候选基因的双功能载体导入根癌农杆菌EHA105，采用农杆菌介导法，将候选基因转化到水稻普感品种新2号，TP309和Co39中。最后一共获得20株独立的转化体。6、PCR分子检测以转化体DNA为模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S启动子的特异性引物对其进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 16 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 17。CaMV35S启动子的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 18 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 19。7、转化体的抗性鉴定选择10个来源地不同，区别力好的独立稻瘟病菌生理小种作为检测的病原菌种。利用稻瘟病菌小种接种感染T2代转基因植株和对照品种，筛选抗病性改变的转化体。抗性鉴定结果显示候选基因RMg5在普感品种新2号的遗传背景下，对5个病原菌株都显示不同程度抗性，表明候选基因RMg5具有特异性抗性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg5的基因结构和蛋白结构分析采用步移法对RMg5的DNA序列进行了测序。RMg5基因DNA长度为4883bp，含有5个开放读码框，4个内含子和5个外显子。RMg5编码的蛋白序列如SEQ ID N0:5所示。RMg5基因编码I个由1071个氨基酸残基组成的蛋白多肽。利用COIL分析表明该蛋白多肽有CC (coiled-coil)结构域。RMg5蛋白属于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端为25个LRR重复。实施例三稻瘟病抗性基因RMg6 (0sllg35210-Tet印)的克隆及鉴定
1、抗稻瘟病候选位点RMg6的确定(1)以单基因形式存在，在日本晴和93-11中各有一个拷贝；(2)在其LRR区域，特别是xxLxLxx区域具有较高的Ka/Ks值；
2、稻瘟病抗性基因RMg6的分离与克隆利用公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)和93-11为参考序列，设计引物(引物两端皆带有酶切位点AscI)。引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 14所示；反向引物序列如SEQ ID NO 15所示。以抗病水稻品种Tet印，谷梅2号和Q2436为模板，利用长片段PCR技术(Long-PCR)扩增候选基因片段。PCR程序如下95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，60°C复性45秒，68°C延伸6. 5分钟，共35个循环，随后72°C保温10分钟，最后10°C恒温。随后对PCR产物进行割胶回收。3、双功能基础载体的准备将稀有酶切位点AscI导入双功能载体pCAMBIA1300的多克隆位点BamHI和SalI之间，取代酶切位点XbaI，构成基础载体pCAMBIA1300-AscI。4、候选抗性基因与基础载体的连接用限制性内切酶AscI，同时酶切PCR产物与基础载体质粒，并纯化。在T4连接酶的作用下，将候选基因片段连入基础载体pCAMBIA1300-AscI。5、候选抗性基因的遗传转化将携有候选基因的双功能载体导入根癌农杆菌EHA105，采用农杆菌介导法，将候选基因转化到水稻普感品种新2号，TP309和Co39中。最后一共获得20株独立的转化体。6、PCR分子检测以转化体DNA为模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S启动子的特异性引物对其进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 16 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 17。CaMV35S启动子的引物序列参加序列表，正向引物序列如SEQ ID NO: 18 ;反向引物序列如SEQ ID NO: 19。7、转化体的抗性鉴定选择10个来源地不同，区别力好的独立稻瘟病菌生理小种作为检测的病原菌种。利用稻 瘟病菌小种接种感染T2代转基因植株和对照品种，筛选抗病性改变的转化体。抗性鉴定结果显示候选基因RMg6在普感品种新2号的遗传背景下，对4个病原菌株都显示不同程度抗性，表明候选基因RMg6具有特异性抗性且被成功克隆。8、稻瘟病抗性基因RMg6的基因结构和蛋白结构分析采用步移法对RMg6的DNA序列进行了测序。RMg6基因DNA长度为3855bp，含有I个开放读码框，无内含子和I个外显子。RMg6编码的蛋白序列如SEQ ID N0:8所示。RMg6基因编码I个由1284个氨基酸残基组成的蛋白多肽。利用COIL分析表明该蛋白多肽有CC (coiled-coil)结构域。RMg6蛋白属于NBS-LRR蛋白其蛋白的C-末端为27个LRR重复。


本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因RMg4或RMg5或RMg6及其应用。本发明公开了水稻稻瘟病新抗性基因RMg4,RMg5和RMg6的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。此三个基因皆属于NBS-LRR类型抗病基因家族的成员。本发明中的三个抗稻瘟病基因均克隆自对稻瘟病菌表现出高抗的水稻品系，并将其转化至对稻瘟病菌感病的品种中，利用稻瘟病菌侵染的方法对其抗病能力进行评估，从而最终确定该三个基因对水稻稻瘟病具有抗性。