专利名称：一种金黄色葡萄球菌滤液制剂的制造及检定方法 金黄色葡萄球菌滤液制剂是用金黄色葡萄球菌经培养除菌过滤制成的淡黄色澄明液体，用于治疗骨折，能促进骨痂生长，加速骨折愈合。另外，对因放化疗而致的白细胞减少有一定保护作用，能提高机体免疫功能，可用于恶性肿瘤病人放化疗的辅助治疗。作为生物制品新药，其制造及检定方法已被纳入《中国生物制品规程》2000年暂行版。但是，原制造及检定方法存在着严重的不足，主要表现为1、原制造及检定方法中，产品的有效成份不明确，《中国生物制品规程》以产品所含的血浆蛋白凝固酶活性代替有效成份作为产品的质量控制指标。经大量的临床应用及试验，证实血浆蛋白凝固酶不是该产品的有效成份，在常温下，其活性下降很快，而产品所含有的临床治疗效果的成份却在常温下十分稳定，两者之间并不存在着一定的关系，且本身血浆蛋白凝固酶活性的检测方法也有很多的不稳定因素，所以用测定产品所含的血浆蛋白凝固酶活性，无法达到控制产品的质量及正确评价临床治疗效果的目的。2、原制造及检定方法中，生产用培养基配制没有相应质量指标控制，导致生产的原液批与批之间质量差异较大，影响产品质量的稳定性。3、原制造及检定方法中，金黄色葡萄球菌滤液制剂是金黄色葡萄球菌经40～48小时培养后通过0.22μm除菌过滤，再经调pH、调渗透压后就分装成成品，其成品内存在着大量的无临床治疗效果的大分子异源物质，经肌内注射进入人体内容易引起人体的拮抗反应，以致病人出局部肿痛、发热等不良反应。
本发明目的在于提供一种克服上述缺点的金黄色葡萄球菌滤液制剂的制造及检定方法。本发明的目的是通过如下措施来实现的一种金黄色葡萄球菌滤液制剂的制造及检定方法，其特征是在除菌过滤工序后面增加纯化工艺，其步骤如下取培养基过滤液，通过5～7万道尔顿分子的超滤膜，除去分子量大于5万道尔顿大分子的物质后留用。对于培养基的质量控制，控制总氮含量为0.133～0.263％，氨基氮含量为0.040～0.088％，游离氨基酸含量为2.19～5.16g/L。其氨基氮的测定步骤如下a)吸取培养基5ml，加水15ml，加入溴麝香草酚蓝指示液0.25ml，调节pH值至中性(翠绿色)。b)吸取样品5ml，加中性甲醛溶液2ml，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至紫色。c)氨基氮含量按下式计算氨基氮含量＝V×c×0.014÷G×100％式中V——标准氢氧化钠溶液消耗的体积，ml；c——氢氧化钠滴定液的浓度，mol/LG——取样量对金黄色葡萄球菌肠毒素进行测定，可以采用反向被动凝集试验，其测定步骤如下(1)选用清洁的微量反应板一块，进行5孔以上编号，从每排第2孔开始，每孔加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)Xμl，其X为10-50范围内的一个选定值，至最末孔。(2)分别吸取金黄色葡萄球菌滤液制剂(成品、半成品或原液)Xμl加入第1孔和第2孔，混匀，从第2孔开始作倍比稀释至倒数第2孔(即第2孔吸25μl至第三孔，混匀，余者类推)，倒数第2孔吸出Xμl弃之，最末孔不加标本作阴性对照。
(3)每孔分别加入血凝试剂或乳胶试剂Xμl。若加入的是乳胶试剂，应按上述两个步骤再作一排试验第一排和第二排中分别加入用抗体致敏的胶乳试剂及正常兔IgG致敏的胶乳试剂各Xμl。
(4)同法作阳性对照标本的凝集试验(对照标本为葡萄球菌肠毒素标准品)。
(5)加样毕，将微量反应板在微型振荡器上充分混匀数分钟，将试验板置密闭的容器中，于一定的温度下放置数小时后观察凝集结果。
(6)结果判定凡孔中试剂凝集铺盖整个孔底者为(3+)，凡孔中试剂凝集铺盖3/4孔底者为(2+)，凡孔中试剂凝集铺盖1/2～1/3孔底者为(+)，凡孔中试剂凝集于孔底但略有少量凝集者为(±)，凡孔中试剂整个聚集于孔底者判为(-)。
若用乳胶试剂，则正常兔IgG致敏的对照胶乳试剂所作试验应无凝集现象，否则试验重做。
(7)金黄色葡萄球菌肠毒素的含量计算先计算出所用试剂的敏感度＝所加阳性对照品含量÷阳性对照品出现(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，再乘以样品出现同样(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，即为样品中金黄色葡萄球菌肠毒素的实际含量。
本发明的优点和积极效果
1.本发明找到了金黄色葡萄球菌滤液制剂产品的有效成份—金黄色葡萄球菌肠毒素，将其作为质量控制指标，并选出了用于检测金黄色葡萄球菌肠毒的方法—反向被动凝集试验，此检测方法具有灵敏度高、更稳定等优点，达到了对金黄色葡萄球菌滤液制剂质量的有效控制和其临床疗效的科学评价的目的。
2.本发明用客观的检测指标克服了原制造及检定方法的培养基配制的时没有质量控制指标的缺陷，对金黄色葡萄球菌滤液制剂的质量起到了重要作用。
3.本发明增加了纯化工艺，通过超滤除去了原产品中存在的无临床疗效的大分子异源物质，降低了金黄色葡萄球菌滤液制剂在临床应用上的不良反应。


下面结合附图和实施例进一步说明本发明。
图1是反向被动凝集试验结果图其中凡孔中胶乳试剂凝集铺盖整个孔底者为(3+)，凡孔中胶乳试剂凝集铺盖3/4孔底者为(2+)，凡孔中胶乳试剂凝集铺盖1/2～1/3孔底者为(+)，凡孔中胶乳试剂凝集于孔底但略有少量凝集者为(±)，凡孔中胶乳试剂整个聚集于孔底者判为(-)。
具体实施方案实施例1金黄色葡萄球菌滤液制剂的制造方法依照中国生物制品规程的规定，进行培养基的制造取5kg新鲜猪心，去血管及筋膜，用注射用水洗净沥干，称取3kg加约1.5倍注射用水，加热90～95℃，保温1小时，趁热纱布过滤，残渣中再加1倍量注射用水，90～95℃保温半小时，过滤去渣，合并两次滤液，加50g氯化钠和100g蛋白胨，用稀盐酸调pH值至3.0～4.0，置2～8℃放置12个小时，除菌滤筒过滤，滤液加2％的活性炭，加热煮沸15分钟，除菌滤筒过滤，待滤液冷至室温，用2％的氢氧化钠溶液调pH值至8.0～9.0，置2～8℃放置12个小时，除菌滤筒过滤，滤液调pH值至中性，加2％活性炭，搅拌15分钟，置2～8℃放置12个小时，除菌滤筒过滤除碳，滤液添加注射用水至10000ml，精调pH值至7.5，分装后用0.1MPa 20分钟高压灭菌，经检验合格后备用。
菌种复苏取冻干保存的金黄色葡萄球菌(菌号SJM91096)一支，启开后，加入0.2ml灭菌生理盐水，吸0.05ml划种血平板及营养琼脂平板，35℃±1℃培养18-24小时，再转种至复苏培养基中35℃±1℃培养18-24小时，经形态、纯度、玻片凝集试验检查合格后，转种若干血平板、营养琼脂平板，35℃±1℃培养18-24小时。从中挑取5个以上典型菌落接种于种子增菌培养基中，35℃±1℃培养18-24小时，供生产接种用。
接种18-24小时生长良好经检验合格的种子增菌培养基以1.5％的比例接种于生产用培养基中，置于35℃±1℃培养40-48小时。
除菌过滤经40～48小时培养后的生产培养基，涂片革兰氏染色镜检，有杂菌生长者废弃。经纯菌检查合格的培养液进行合并。然后经0.22μm除菌滤膜过滤除菌成培养基过滤液。
在除菌过滤工序后面增加纯化工艺，其纯化步骤如下取培养基过滤液，通过5～7万道尔顿分子的超滤膜，除去分子量大于5万道尔顿大分子物质，滤液即为原液，经检验合格后留用。
半成品配制取合格的原液，用注射用水调原液中的金黄色葡萄球菌肠毒素(Superantigen，SAg)的含量在1.5ng～25ng/ml范围内，然后用氯化钠调其渗透压与0.9％的生理氯化钠溶液的渗透压比值在1.00±0.05范围之内，即为半成品。
金黄色葡萄球菌滤液制剂的检定方法原来的金黄色葡萄球菌滤液制剂检定方法里，是用检测其所含的血浆蛋白凝固酶的活性来代替其活性成份的检定。本发明已找到了金黄色葡萄球菌滤液制剂的活性成份—金黄色葡萄球菌肠毒素(Superantigen，SAg)，并以检测金黄色葡萄球菌滤液制剂中的金黄色葡萄球菌肠毒素(Superantigen，SAg)的含量作为金黄色葡萄球菌滤液制剂的检定方法。
当所用凝集试剂为血凝试剂时，其检定步骤如下1、取清洁的平底微量反应板一块，编号，从每排第2孔开始，每孔分别加入PBS溶液(pH为7.4)25μl，至第8孔。
2、吸取金黄色葡萄球菌滤液制剂25μl加入第1孔和第2孔，混匀，从第2孔开始作倍比稀释至第7孔(即从第2孔吸25μl至第三孔，混匀，余者类推)，从第7孔中吸25μl弃之，第8孔作阴性对照。
3、每孔各加入血凝试剂25μl。
4、同法作一排阳性对照标本的血凝集试验(对照标本为葡萄球菌肠毒素标准品)。
5、将加好血凝试剂的微量反应板置微型振荡器上充分振荡混匀1～2分钟，并将血凝板放入潮湿的容器中于37℃孵育1.5～2.0小时，取出观察结果。
6、结果判定(如图1所示)凡孔中试剂凝集铺盖整个孔底者为(3+)，凡孔中试剂凝集铺盖3/4孔底者为(2+)，凡孔中试剂凝集铺盖1/2～1/3孔底者为(+)，凡孔中试剂凝集于孔底但略有少量凝集者为(±)，凡孔中试剂整个聚集于孔底者判为(-)。
7、金黄色葡萄球菌肠毒素的含量计算先计算出所用试剂的敏感度＝所加阳性对照品含量÷阳性对照品出现(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，再乘以样品出现同样(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，即为样品中金黄色葡萄球菌肠毒素的实际含量。
举例阳性对照标本含量为50ng/ml，在1∶16稀释出现血凝强度(+)，则其敏感度为50/16＝3.125ng/ml。
若被检标本在1∶32稀释出现血凝强度(+)，则被检样品中金黄色葡萄球菌肠毒素的实际含量＝3.125×32＝100ng/ml。
当所用凝集试剂为乳胶试剂时，其检定步骤如下1、取清洁的平底微量反应板一块，编号，从每排第2孔开始，每孔分别加入PBS溶液(pH为7.4)25μl，至第8孔。
2、吸取金黄色葡萄球菌滤液制剂25μl加入第1孔和第2孔，混匀，从第2孔开始作倍比稀释至第7孔(即从第2孔吸25μl至第三孔，混匀，余者类推)，从第7孔中吸25μl弃之，第8孔作阴性对照。
3、每个标本需作两排试验于第一排和第二排中分别加入用抗体致敏的胶乳试剂及正常兔IgG致敏的胶乳试剂25μl。
4、同法作阳性对照标本的胶乳凝集试验(对照标本为葡萄球菌肠毒素标准品)。
5、加样毕，将微量反应板在微型振荡器上充分混匀1～2分钟，将试验板置密闭的容器中，于室温(20～25℃)放置18～20小时后观察凝集结果。
6、结果判定(如图1所示)凡孔中试剂凝集铺盖整个孔底者为(3+)，凡孔中试剂凝集铺盖3/4孔底者为(2+)，凡孔中试剂凝集铺盖1/2～1/3孔底者为(+)，凡孔中试剂凝集于孔底但略有少量凝集者为(±)，凡孔中试剂整个聚集于孔底者判为(-)。
用正常兔IgG致敏的对照胶乳试剂所作试验应无凝集现象。
7、金黄色葡萄球菌肠毒素的含量计算先计算出所用试剂的敏感度＝所加阳性对照品含量÷阳性对照品出现(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，再乘以样品出现同样(2+)或(+)凝集强度的稀释倍数，即为样品中金黄色葡萄球菌肠毒素的实际含量。
举例阳性对照标本含量为50ng/ml，在1∶64稀释出现血凝强度(+)，则其敏感度为50/64＝0.78125ng/ml。
若被检标本在1∶128稀释出现血凝强度(+)，则被检样品中金黄色葡萄球菌肠毒素的实际含量＝0.78125×128＝100ng/ml。
生产用培养基的质量标准及检定方法原制造及检定方法中对培养基并无质量标准，本发明制定了合理的质量标准及检定方法，具体方法如下培养基的质量标准总氮含量应为 0.133～0.263％氨基氮含量应为 0.040～0.088％游离氨基酸含量为 2.19～5.16g/L总氮的检测方法采用《中国药典》2000版二部附录VIID的第二法测定。
氨基氮的测定精密吸取培养基5ml，加水15ml，加入溴麝香草酚蓝指示液0.25ml，调节pH值至中性(翠绿色)。
精密吸取本品5ml，加中性甲醛溶液2ml，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至紫色。
按下式计算氨基氮含量＝V×c×0.014÷G×100％式中 V——标准氢氧化钠溶液消耗的体积，ml；c——氢氧化钠滴定液的浓度，mol/LG——取样量游离氨基氮的测定照高效液相色谱法《中国药典》2000版二部附录VD的测定。
色谱条件与系统适用性试验 用symmetry C18柱；检测波长为248nm；流速为0.8-1.0ml/分钟；柱温38℃。
流动相的配制A液19.04g三水乙酸钠加1000ml高纯水溶解，用稀磷酸(1∶1)调pH至5.2，加1mlEDTA溶液(1mg/ml)、0.1g叠氮化钠NaN3，加2.37ml三乙胺后，用稀磷酸(1∶1)调pH至4.95。经0.45μm水相滤膜过滤并超声脱气后再使用。
B液用0.45μm有机相滤膜过滤HPLC级乙腈，加水混合均匀(比例为3∶2)，超声脱气20秒即可。
C液高纯水流动相A液、B液C液的比例运行时间(分钟) A液％B液％ C液％1 98.2 2.0018 96.5 3.5019 95 5 022 91.5 8.5029 83 7 0
40 100 0 060 604001000 6040测定方法(1)标准氨基酸的浓度天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸均为2.5μmol/ml，胱氨酸为1.25μmol/ml。
(2)供试品的制备取本品适量，适当稀释后与衍生剂AQC(6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯)20μl置入衍生管内，反应15秒钟后，加硼酸盐缓冲液60μl，室温放置30分钟，作为供试品。
(3)标准品的制备取上述标准氨基酸溶液适量，适当稀释后与供试品同等条件下衍生作为标准工作液。
(4)图谱的制备分别取供试品溶液与标准品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录图谱，按外标法以峰面积计算即可。


一种金黄色葡萄球菌滤液制剂的制造及检定方法，包括原液制备，其特征是在除菌过滤工序后面增加纯化工艺，除去了原产品中存在的无临床疗效的大分子异源物质。本发明通过对金黄色葡萄球菌肠毒素进行反向被动凝集试验，用客观的检测指标，来控制产品的质量；通过建立对培养基的检定方法，提高了产品质量的稳定性。