n-3多不饱和脂肪酸在治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用的制作方法技术领域：】，特别涉及一种n-3多不饱和脂肪酸在治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。本发明以本实验室酶法制得纯度达到80%的triEPA和triDHA为材料，研究其对小鼠模型NAFLD的预防与改善作用，为n-3PUFA预防和治疗NAFLD、为开发利用深海鱼油资源提供理论基础和依据，对以营养手段预防和治疗NAFLD，减轻其危害具有重要意义。技术领域：】[0001]本发明属于医药【技术领域：】，特别涉及一种n-3多不饱和脂肪酸在治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。【背景技术：】[0002]NAFLD是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的、以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。非酒精性脂肪肝疾患在形态学上可分为4类，即单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化。在西方国家NAFLD的发病率约占平均人口的10%，而在肥胖者中则高达50%。近代随着社会经济的快速发展，肥胖与糖尿病等各种“富贵病”发病率的增加，非酒精性脂肪性肝病患病率也飞速提高，现在已经成为危害人类健康的三大肝病之一。大量研究表明，NAFLD不仅导致肝脏相关疾病和死亡，而且与动脉粥样硬化性心血管疾病的高发密切相关。目前尚无NAFLD的特效药物，临床上主要是根据具体的病情采用个体化治疗，主要是基础治疗、保肝药物治疗、原位肝移植治疗的三阶梯疗法。而近年来的研究表明，n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)有可能作为治疗NAFLD有效手段。但以往研究使用的是普通鱼油即二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)及其他不饱和脂肪酸的混合物，其纯度低，而体内和体外研究表明EPA和DHA的作用功效是不同的，不能明确究竟是何种n-3PUFA在改善NAFLD中发挥作用，因此有必要使用DHA和EPA单独干预来研究其预防和改善NAFLD作用。【
发明内容】[0003]本发明的目的在于提供一种n-3多不饱和脂肪酸在治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。[0004]本发明以EPA三甘油三酯(triEPA)和DHA三甘油三酯(triDHA)为材料，研究其对非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型小鼠的预防与改善作用。取雄性小鼠(小鼠品系)40只，按体重随机分为对照组、triEPA补充组、triDHA补充组、模型组，每组10只小鼠。除对照组喂正常饲料外，其余各组都喂以高脂饲料，triEPA和triDHA补充组每天以1000mg/kgbw(bodyweight体重)的triEPA和triDHA乳化液灌胃，对照组和模型组每日以等量的5%阿拉伯胶溶液灌胃，饲养8w后处死小鼠，收集血液和肝脏标本。采用HE染色法观察肝脏的病变情况并测定血清谷丙转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和肝脏TG、TC。高脂饲料诱导引起小鼠肝脏脂肪性变，triEPA和triDHA补充高脂饲料诱导的NAFLD模型小鼠8w后，显著降低了小鼠的肝重系数、血清ALT和AST活性，降低了肝脏TG和TC水平，显著降低肝脏的脂变程度。试验结果证明，triEPA和triDHA对小鼠NAFLD有积极的预防和改善作用。[0005]作为优选，所述的n-3多不饱和脂肪酸为EPA三甘油三酯(triEPA)或DHA三甘油三酯(triDHA)。[0006]本发明以本实验室酶法制得纯度达到80%的triEPA和triDHA为材料，研究其对小鼠模型NAFLD的预防与改善作用，为n-3PUFA预防和治疗NAFLD、为开发利用深海鱼油资源提供理论基础和依据，对以营养手段预防和治疗NAFLD，减轻其危害具有重要意义。[0007]图1是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠体重的影响图；图2是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠饲料摄入量的影响图；图3是HE染色显微镜图(400X)，其中a.对照组；b.triEPA补充组；c.triDHA补充组；d.模型组；图4是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠干重指数的影响图，与模型组比较a:P<0.05,b:P<0.01；图5是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血清转氨酶活力的影响图，与模型组比较a:P<0.05，b:P<0.01；图6是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血清TG和TC含量的影响图，与模型组比较a:P<0.05，b:P<0.01；图7是n-3多不饱和脂肪酸对小鼠肝脏TG和TC含量的影响图，与模型组比较a:P<0.05，b:P<0.01ο[0008]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。[0009]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。[0010]实施例:I材料与方法1.1材料饲料:基础饲料(蛋白质脂肪碳水化合物产热比为25.2:11.9:62.9)由浙江省医学科学院提供。闻脂词料(蛋白质脂肪碳水化合物广热比为14.6:48.6:36.7)由基础词料掺入1%胆固醇，20%脂肪(C14:02%C16:033%C16:l2%C18:020%C18:l29%C18:212%C20:02%)，由浙江省医学科学院制得。[0011]n-3PUFA:triEPA和triDHA由本实验室通过酶法制备而成并以5%阿拉伯胶溶液制备为乳化液。具体过程可参看申请号200810162265、名称为“一种连续化酶促合成n-3PUFA甘油酯的方法”的发明专利。[0012]检测试剂:梯度浓度脱水酒精；HE染色试液；天冬氨酸氨基转移酶检测试剂(酶速率法)，丙氨酸氨基转氨酶试剂(酶速率法)，甘油三酯(TG)检测试剂(终点比色法)，总胆固醇(TC)检测试剂(终点比色法)，以上4种生化试剂购自贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司。[0013]仪器设备:UNICOUV-2800紫外可见分光光度计，普通小鼠饲养笼及饮水器，Leica石蜡切片机RM2235，安亭低速离心机LXJ-1IB，贝克曼生化分析系统LX20，仪康光学显微镜TV-3100。[0014]实验动物:C57BL/6J雄性小鼠9-10w龄，体重在(25±2)g，SPF级，由浙江省医学科学院提供。实验动物生产许可证号:SYXK(浙)2012-0176。[0015]1.2方法实验分组及干预方法:40只小鼠在饲养环境中适应性饲养120h后，按体重随机分成4组，每组10只，分别为:正常对照组、triEPA补充组、triDHA补充组、高脂模型组，每个饲养笼5只小鼠，并编号。采用高脂饮食建立小鼠NAFLD模型。正常组喂基础饲料，其他各组均喂高脂饲料。定期观察并记录小鼠日常状况，每日定时称量小鼠体重并分别灌胃0.5ml的5%阿拉伯胶溶液、triEPA(1000mg/kgd)、triDHA(1000mg/kgd)、5%阿拉伯胶溶液。[0016]样品收集:饲养8w后的小鼠，禁食12h，称量体重，采用眼球采血法采血，用带有分离胶的采血管收集，采血后用颈椎脱白法处死，迅速解剖取出肝脏，肉眼观察肝脏并记录结果后，用生理盐水清洗，用吸水纸吸干表面水分后称重，放入10%的中性甲醛固定液中固定3d。[0017]指标检测:米集得的血液样品在室温下静直Ih后，4000r/min，尚心5min，收集血清。采用SYNCHR0N生化分析系统检测谷丙转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)酶活力、血清TG、TC水平。[0018]肝脏TG、TC含量检测称取约0.2g的肝脏组织以氯仿:甲醇(2:1)萃取的方法提取[1]，萃取得到的总脂用含50mg/L2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的氯仿定容于IOml容量瓶中。取上述萃取液0.5ml，采用Sidney等的方法测定肝脏TG含量[2]。取上述萃取液0.4ml，采用Ness等的方法测定肝脏胆固醇含量[3]。[0019]病理学检查:(1)肉眼观察新鲜肝脏，(2)肝脏HE染色:固定后的肝脏取一小片经酒精梯度脱水，二甲苯透明化后制成蜡块，切片后采用HE染色法染色，镜检并拍照，结果见图3。[0020]统计学方法:采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，数据以均值土标准差表/Jnο[0021]2结果2.1体重和摄食量如图1所示，在整个8w的实验期间，各组间小鼠体重间没有显著差异。在每周食量方面，如图2所示，第Iw到第8w，各组小鼠的食量均有所上升，对照组增长最快，模型组增长最慢。模型组饲料摄入量明显较其他各组低，而体重增长与其他各组无异。[0022]2.2病理学检查肉眼观察:对照组肝脏颜色呈鲜红色，而模型组小鼠肝脏颜色呈黄褐色，明显较对照组肿大，且表面带有油腻感。triEPA补充组、triDHA补充组小鼠肝脏肿大程度则较模型组有较大减轻，颜色较红。[0023]图3是HE染色显微镜图(400X)，其中a.对照组；b.triEPA补充组；c.triDHA补充组；d.模型组。HE染色:模型组的病变程度较为严重，肝脏内细胞大小不一并且出现局部坏死，肝细胞内的脂质被酒精和二甲苯溶解脱去后形成多数的空泡，肝小叶结构出现异常，边界与结构不明显，肝索结构凌乱，肝血窦由于受肝胞浆内大脂滴挤压变窄而不明显。与模型组比，triEPA补充组、triDHA补充组的肝脏病变程度较轻，肝索结构基本正常呈放射状，肝细胞内出现少数空泡，肝小叶结构基本正常，肝血窦较明显，而对照组未出现异常现象。[0024]2.3n-3PUFA对小鼠肝重指数的影响如图4所示，模型组小鼠肝重指数极显著高于对照组小鼠UKQ.01)。与模型组相比，经过8w，triEPA和triDHA补充后小鼠肝重指数显著降低0°〈0.05)，triEPA补充组、triDHA补充组和对照组小鼠肝重指数无显著差异。[0025]2.4n-3PUFA对小鼠血清转氨酶水平的影响模型组小鼠的ALT值和AST值极显著高于对照组(/X0.01)，见图5。与模型组小鼠相t匕，经过8w，triEPA和triDHA补充后，triEPA和triDHA补充组小鼠ALT活性和AST活性显著降低0°〈0.01)0°〈0.05)。[0026]2.5n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血清TG、TC的影响如图6所示，模型组血清TG和TC含量均显著高于组0°〈0.01，IKQ.05)，而triEPA、triDHA补充组小鼠与模型组小鼠的血清TG和TC未出现显著性差异。[0027]2.6n-3PUFA对小鼠肝脂含量的影响如图7所示，模型组小鼠肝脏TG和TC含量均显著高于triEPA补充组、triDHA补充组和对照组小鼠。与模型组小鼠相比，经过8w，triEPA和triDHA补充显著降低了小鼠肝脏TG和TC的含量O°〈0.05)，数据显示triEPA和triDHA补充小鼠肝脏TG分别下降了38.4%和42.1%，TC含量分别下降了36.0%和40.8%。triEPA补充组和triDHA补充组肝脏TC和TG含量不存在显著差异。[0028]3讨论NAFLD已成为危害人类健康的三大肝病之一，目前尚无NAFLD特效药物。目前，研究表明n-3PUFA对NAFLD有积极地改善作用，但这些研究往往采用的是n_3PUFA的游离型或者乙酯型，不同化学型式对在人体中吸收的情况也有明显的差异。例如普通鱼油或浓缩的鱼油产品一般为乙酯型，而乙酯型的吸收率仅为21%，游离型的EPA和DHA虽然吸收率为95%，但容易氧化，很不稳定，且由于对消化道有刺激作用，而甘油三酯型符合人体吸收的油脂形式，其人体吸收率明显高于乙酯型鱼油，吸收可以达到60%左右，性质相对稳定。研究结果表明空白组和模型组的血液ALT、AST，肝脏TG、TC指标均存在显著性差异，并且模型组肝脏HE染色结果明显呈现病态，说明小鼠非酒精性脂肪肝的建模是成功的。[0029]3.1n-3PUFA与脂质代谢n-3PUFA能调节脂质代谢，主要表现在调节脂肪生成相关基因的表达、促进脂肪分解及抑制脂肪生成。一方面，n-3PUFA对细胞膜脂有极强的亲和性，在与细胞膜结合后，改变细胞膜组成；在一定程度上，n-3PUFA上调一些与促进脂解相关的信号蛋白，如肿瘤坏死因子-α和淀粉样蛋白Α，提高肾上腺素和去甲肾上腺素等脂解激素的含量，促进脂肪动员，减少肝脏脂肪的堆积，有利于β氧化或转化为其他物质。另一方面n-3PUFA调节SREBP-1、NF-Y等生脂基因转录因子，抑制肝脏脂肪的合成。此外n-3PUFA可以抑制极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)的合成及结合受体的活性，而增加高密度脂蛋白(HDL)的水平及结合受体的活性，进而加速胆固醇被运入肝脏被代谢清除。本研究显示，给予triEPA和triDHA的小鼠的肝脏脂质含量均较模型组显著降低，因此triEPA和triDHA减少肝脏脂质的堆积，从而减轻后续的氧化应激等生理反应，抑制非酒精性脂肪肝病情的发展。[0030]3.2血清转氨酶与肝细胞损伤血清转氨酶ALT和AST是肝细胞损伤时最敏感的指标，AST大部分存在于肝细胞的线粒体中，而ALT则主要存在于细胞质中，只有在肝细胞受到损伤时才大量会被释放到血液中。本研究中，triEPA补充组和triDHA补充组小鼠血清ALT和AST值均比模型组有显著下降，与HE染色所得结果一致，说明triEPA和triDHA能有效降低肝脏细胞内脂肪过度堆积所引起的细胞损害。[0031]3.3EPA和DHA作用效果比较triEPA和triDHA补充后，两组小鼠之间ALT、AST、TG、TC和TG、TC含量和病理学检查结果未发现有显著差异，有可能两者对非酒精性脂肪肝能起到相似的改善作用，因此对非酒精性脂肪肝的干预可以采用DHA和EPA的混合物来进行。[0032]综上，高脂饲料诱导引起小鼠肝脏脂肪性变，其肝重系数、TG和TC显著增加，肝脏组织病理学检查呈现病态。而以triEPA和triDHA补充高脂饲料诱导的NAFLD模型小鼠8w后，显著降低了小鼠的肝重系数、ALT和AST活性，降低了肝脏TG、TC水平，肝脏的脂变程度显著降低，这些研究结果表明triEPA和triDHA对小鼠非酒精性脂肪肝有积极的预防和改善作用。[0033]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。[0034]参考文献:[1]FlochJjLeesMjSloaneStanleyGH.AsimplemethodfortheisolationandPurificationoftotallipidsformanimaltissues[J].JBiolChem，1957:497-509.[2]GottfriedSPjRosenbergB.1mprovedmanualspectrophotometrieprocedurefordeterminationofserumtriglycerides[J].ClinChem，1973，19:1077-1078.[3]NessAT，PastewkaJVjPeacockAC.EvaluationofaRecentlyReportedStableLiebermaml-BurehardReagentandItsUsefortheDirectDeterminationofSerumTotalCholesterol[J].ClinChimActa,1964，10:229-237.陈小娥,方旭波,袁高峰,董坚申请人:浙江海洋学院