专利名称：一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用的制作方法肝脏疾病如慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、代谢障碍引起的肝病、药物及其它原因引起的中毒性肝病、自身免疫性肝病等是临床常见病，对机体健康危害极大，其中许多疾病尚没有很有效的治疗手段，迫切需要新型治疗方法或药物，而肝脏或肝细胞特异的基因治疗方法具有潜在的药物开发价值。基因治疗最关键的同时也是最困难的问题在于如何将外源基因特异并高效地导入特定组织器官内的特定类型的靶细胞，并使其在靶细胞内持续性地表达。对肝脏的基因导入尤为困难，由于肝内kupffer (枯否氏)细胞的吞噬作用，用脂质体方法很难有效地将外源基因导入肝实质细胞；而使用现有的重组病毒载体如腺病毒载体、慢病毒载体等将外源基因导入到肝实质细胞的效果也不理想，原因至少可部分归结于这些病毒的感染并不是肝特异性的。相对现有的重组病毒载体，人乙型肝炎病毒(HBV)(以下简称乙肝病毒)只感染人肝细胞，因此，是否能够利用乙肝病毒的这一特点将其开发为肝脏基因治疗的重组病毒载体一直受到关注。乙肝病毒具有部分环状双链的DNA基因组，长度约为3. 2kb，含有四个基本阅读框架，它们分别是C基因，编码核心蛋白(核心抗原)和分泌的e蛋白(e抗原)；S基因，编码大、中和小表面蛋白(表面抗原)，大蛋白和中蛋白相比小蛋白，在氣基端分别多preS (由preSl+preS2组成)和preS2 ;P基因，编码聚合酶；X基因，编码X蛋白。乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上，通过未知的机制，病毒外膜与细胞膜发生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚，病毒基因组转移到细胞核内，在细胞修复酶的作用下形成闭合环状DNA (cccDNA)o随后，病毒以cccDNA为模板转录产生四种mRNA,分别是 3. 5kb pgRNA、2. 4kb mRNA,2. Ikb mRNA 和 O. 8kb mRNA。2. 4kb 和 2. Ikb 的 mRNA 指导表面蛋白的翻译，O. 8kb mRNA指导X蛋白的翻译,而3. 5kb pgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外，还作为病毒的前基因组RNA被新产生的核心蛋白和聚合酶包裹形成新的核衣壳。在核衣壳中，病毒聚合酶以PgRNA为模板通过反转录合成新的DNA基因组。最终，完成DNA复制的核衣壳被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出细胞，开始新的感染周期。乙肝病毒的聚合酶在病毒DNA的复制中占有核心地位。不同基因型的乙肝病毒的聚合酶大小稍有差异。聚合酶可分为四个结构域，分别为末端蛋白(TP)、间隔区(Spacer或SP)、反转录酶(RT)和核酸酶H (RNaseH)。TP、RT和RNaseH活性在乙肝病毒DNA的复制中都不可缺少，而SP的功能不是很清楚，可能主要起连接TP和RT的作用。乙肝病毒的嗜肝性主要体现在感染细胞和病毒基因转录调控两个层面上。首先，乙肝病毒选择性地感染人肝细胞；其次，乙肝病毒基因的转录受到病毒携带的四个启动子和两个增强子的调控，许多肝细胞特异或富集的转录调控因子参与调节这些元件的活性〔Seeger C and Mason ff, 2000. Microbiol. MoI. Biol. Rev. 64:51-68〕。乙肝病毒的嗜肝性使其在理论上有可能成为肝脏基因治疗的理想病毒载体。但是，由于乙肝病毒的基因组很小，仅为3. 2kb，病毒基因之间及基因与调控区之间相互重叠，病毒核衣壳的容量又极为有限(实验证明基因组DNA若大于3. 5kb就无法检测到病毒的复制)，因此，对乙肝病毒基因组进行人工改造使其能够容纳一定长度的外源基因，且不影响病毒的高效复制就显得非常困难，国际上的一些尝试都未能获得成功(Chaisomchit S，Tyrrell D, Chang L, 1997. Gene Therapy. 4:1330-1340)。
本发明的目的是提供一种在肝脏细胞中特异表达外源基因的载体。 本发明的另一个目的是提供上述载体在基因治疗中的应用。利用乙肝病毒的嗜肝性可以将其开发为肝脏特异的重组病毒载体，关键技术是如何在乙肝病毒基因组中寻找合适的外源基因插入位点，同时维持病毒的高效复制。在本发明中，对不影响乙肝病毒高效复制的SP结构域的最大缺失范围、在缺失部位插入外源基因后病毒的复制能力以及插入的外源基因的表达进行了详尽的研究。研究结果显示，乙肝病毒聚合酶SP结构域中SP15-SP143残基的缺失，对病毒的高效复制没有明显影响，在该缺失部位处插入678bp的外源基因(ds-red)后,病毒仍具有高效的复制能力，而且插入的外源基因也能在细胞内表达，显示该乙肝病毒缺失体基因组具有作为重组乙肝病毒载体的良好性质。本发明一方面提供了一种基于人乙型肝炎病毒的重组载体，所述病毒基因组相对于野生型乙型肝炎病毒载体，缺失乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或者全部。具体而言，所述病毒基因组含有以下的结构之一 a)附图I和图2中所示的结构及所示部位的缺失，缺失范围位于人乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区(SP区域)； b)含有附图I和图2中所示的结构及所示部位的缺失，缺失范围包括所示缺失部位全部或者部分的任意缺失； c)在(a)(b)所述结构中的所示缺失部位插入了任意外源序列的结构。目前已知人乙肝病毒有8个基因型(A-Η)。各基因型聚合酶Pol的RT和RNaseH区大小完全相同，而TP和SP区大小稍有区别，国际标准将各结构域分别计数。具体就SP而言A、B、C、F、H基因型为169个残基，E、G基因型为168个残基，D基因型为158个残基。按照国际标准计数规则，以A、B、C、F、H基因型的169残基大小为基准，所述的缺失是A、B、C、F、H基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP15-SP143的部分或者全部；或者是E、G基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP14-SP142的部分或者全部；或者是D基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP4-SP132的部分或者全部。本发明的重组载体的制备方法即去除乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或者全部。例如，扩增获得不含有乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或者全部的乙肝病毒载体序列，然后依次拼接。本发明还提供了一种构建物，所述构建物可转录出上述重组人乙肝病毒载体的前基因组RNA。另一方面，本发明提供了一种细胞，该细胞含有上述的重组人乙肝病毒载体或上述的构建物。利用本发明提供的重组人乙肝病毒载体、构建物或细胞可以制备得到高效复制，并有效表达外源基因的重组乙肝病毒。本发明提供的重组乙肝病毒颗粒与野生型乙肝病毒颗粒之间存在的唯一的区别，在于前者所包含的基因组在聚合酶间隔区的SP15-SP143缺失了部分或者全部序列，而该区段不属于乙肝病毒转录调控区，与乙肝病毒的肝细胞特异性基因转录和复制〔Seeger Cand Mason ff, 2000. Microbiol. Mo I. Biol. Rev. 64:51-68〕无关。换言之，重组乙肝病 毒不含有可能影响其嗜肝性的改变，从而为肝脏或肝细胞特异性的基因导入提供了一种条件。例如，将外源基因与本发明的重组载体或者所述的构建物连接，在培养细胞中包装成为重组乙肝病毒颗粒后，以病毒感染方式将外源基因特异性转入肝细胞。相应的，本发明提供了一种用于肝脏靶向的基因治疗药物，所述药物包含上述的重组载体或构建物。所述药物可以是外源基因编码序列与本发明的重组载体或构建物连接构成。本发明中，术语“缺失”指的是本发明所述的重组人乙肝病毒载体，其基因组与野生型乙肝病毒基因组相比较，缺少了一段序列，这段序列的具体位置，由附图I和图2所示。这里的野生型乙肝病毒基因组包括但不限于A、B、C、D、E、F、G、H等乙肝病毒基因型。本发明另一方面还涉及含有上述重组人乙肝病毒载体基因组的构建物，所述构建物可以是DNA形式或RNA形式。本发明的重组人乙肝病毒载体基因组通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的重组乙肝病毒载体基因组结构以及公共数据库中的野生型或突变株乙肝病毒基因组序列设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其插入克隆载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。上述的“克隆载体”指本领域熟知的原核或真核表达质粒。“克隆载体”包含一个或多个选择性标记基因，以用于选择转化或转染的宿主细胞的表型，如真核细胞使用的新霉素抗性，大肠杆菌使用的四环素或氨苄青霉素抗性等。在本发明中，使用本领域的技术人员熟知的方法将包含本发明的重组人乙肝病毒载体基因组插入到克隆载体中。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、体内重组技术等(Sambrook, et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory. New York, 1989)。本文所指的“构建物”是指包含本发明的重组人乙肝病毒载体基因组以及指导其转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列的表达质粒。上述表达质粒可用于转染适当的真核细胞，以使其能够转录出本发明的重组人乙肝病毒载体基因组中含有的病毒基因特别是前基因组RNA。宿主细胞如哺乳动物HuH7、HepG2细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。本发明的重组人乙肝病毒载体可在细胞内表达并分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于密度梯度离心、PEG沉淀等。本发明还涉及上述重组人乙肝病毒载体、构建物或细胞在制备基因治疗药物中的 用途，包括但不限于将其与药学上可接受的物质混合包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween ;润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。本发明涉及一种基于人乙型肝炎病毒的重组病毒载体，本发明还涉及所述重组病毒载体的基因组结构、构建物、细胞和应用。所述的重组载体能高效复制，包装形成重组病毒粒子，并可有效地表达其所携带的外源基因。所述重组病毒载体可用于肝脏及肝细胞特异性的基因导入，及针对包括慢性乙肝在内的肝脏疾病的靶向性基因治疗。本发明的人乙肝病毒重组载体能使插入的外源基因表达，重组乙肝病毒可高效复制，并在提供表面蛋白的情况下形成完整的重组乙肝病毒颗粒，表明本发明的重组人乙肝病毒载体作为肝脏特异性的基因导入载体的应用前景。


图I和图2显示重组人乙肝病毒载体基因组中的缺失部位；图I为乙肝病毒基因组的示意图，重组乙肝病毒载体基因组中的缺失部位以锥形表示；图2显示缺失部位的具体位置。目前已知人乙肝病毒有8个基因型(A-Η)。各基因型聚合酶Pol的RT和RNaseH区大小完全相同，而TP和SP区大小稍有区别，国际标准将各结构域分别计数。具体就SP而言A、B、C、F、H基因型为169个残基，E、G基因型为168个残基，D基因型为158个残基。按照国际标准计数规则，以A、B、C、F、H基因型的169残基大小为基准，重组人乙肝病毒载体基因组中的缺失部位为SP15-SP143。对应E、G基因型中SP14-SP142山基因型中SP4-SP132。图3为实施例中使用的各种构建物的结构示意图。PWT :1. 2拷贝野生型乙肝病毒的基因组结构；CMV-1. IHBV :用CMV启动子替换掉野生型HBV核心启动子(5’端ENII/Cp)的结构，这种替换是实验室提高病毒复制的常规手段；PHY-5c3c :重组人乙肝病毒载体的基因组结构，缺失部位以折线表示，并如图2所示；sp-s :用于反式提供乙肝病毒表面蛋白的质粒示意图；PHY-5c3c-Tat :插入外源基因Tat (表达人免疫缺陷病毒HIV-I的Tat蛋白)后重组乙肝病毒的基因组结构，插入的外源基因灰色长方形表示；PHY-5C3C-red :插入外源基因ds-red (表达红色荧光蛋白)后重组乙肝病毒的基因组结构，插入的外源基因灰色长方形表示。图4为重组人乙肝病毒载体的复制情况以及插入外源基因后重组病毒的复制情况。PWT :野生型乙肝病毒的复制情况；CMV-1. IHBV :用CMV启动子启动的野生型乙肝病毒的复制情况；PHY-5c3c :重组人乙肝病毒载体的复制情况；PHY-5c3c-Tat :插入外源基因Tat后重组乙肝病毒的复制情况；PHY-5C3C-red :插入外源基因ds-red后重组乙肝病毒的复制情况。所有复制实验均在培养肝癌细胞株Huh7中实施。图5和图6为外源基因的表达情况。图5 :含有外源基因Tat的重组乙肝病毒基因组的构建物，与LTR-Iuc质粒共同转染Huh7细胞后，LTR启动的Iuc (荧光素酶)的表达有明显的升高。pcDNA3 pcDNA3空载体与LTR-Iuc共转HuH7细胞后，荧光素酶的表达情况；pcDNA3-Tat :插入外源基因Tat的pcDNA3质粒，与LTR-Iuc共转HuH7细胞后，荧光素酶的表达情况；PHY-5c3c :重组人乙肝病毒载体与LTR-Iuc共转HuH7细胞后，荧光素酶的表达情况；PHY-5c3c-Tat :插入外源基因Tat的重组乙肝病毒与LTR-Iuc共转HuH7细胞后，荧光素酶的表达情况。图6 :含有外源基因ds-red的重组乙肝病毒基因组的构建物转染Huh7细胞后红色荧光蛋白的表达情况。图7为细胞内及培养基中的重组乙肝病毒。通过用PreSl的抗体做pull-down实验，证明了重组乙肝病毒载体PHY-5c3c以及插入外源基因Tat的重组乙肝病毒构建物PHY-5c3c-Tat，均能在反式提供乙肝病毒表面蛋白的情况下，包装出完整的病毒颗粒。

下面以含I. I拷贝的重组人乙肝病毒载体基因组的表达质粒PHY-5C3C (图3)为例说明病毒载体的构建方法。以含有I. I拷贝的野生型乙肝病毒基因组的质粒CMV-1. IHBV(图3)为模板，根据乙肝病毒聚合酶间隔区的SP15-SP143区段上游和下游序列设计相应引物，以反向PCR方法扩增得到缺失上述区段的质粒序列DNA片段，该片段自连后得到相应质粒，即 PHY-5c3c。含I. I拷贝的重组人乙肝病毒载体基因组的表达质粒PHY-5c3c，在病毒载体缺失部位插入了 Tat蛋白基因的表达质粒PHY-5c3c-Tat以及在病毒载体缺失部位插入了红色荧光蛋白基因的表达质粒PHY-5c3c-red转染肝癌细胞株Huh7细胞，转染96小时后，收获并破碎细胞，经DNA酶消化，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀后，荧光定量PCR检测胞内病毒的复制水平。以转染I. 2拷贝野生型病毒表达质粒PWT和CMV启动子启动的野生型病毒表达质粒CMV-1. IHBV的细胞为对照，如附图4所示，不论重组人乙肝病毒载体还是插入小片段(Tat，207bp )或大片段(ds-red, 678bp )基因的重组乙肝病毒都能高效复制。
实施例2 :带有Tat或红色荧光蛋白基因的重组乙肝病毒可以表达外源基因 用重组人乙肝病毒载体基因组的表达质粒PHY-5c3c和带有Tat基因的重组乙肝病毒基因组的表达质粒PHY-5c3c-Tat与LTR启动子启动的荧光素酶表达质粒LTR-Iuc共同转染肝癌细胞株Huh7细胞，转染后48h收细胞，检测荧光素酶的表达情况，并用pcDNA3空质粒和pcDNA3-Tat与LTR-Iuc共同转染肝癌细胞株Huh7细胞，作为阴性对照和阳性对照；结果如附图5所示，PHY-5c3c-Tat中的Tat蛋白可以有效的表达；含I. I拷贝带有红色荧光蛋白基因的重组乙肝病毒基因组的表达质粒PHY-5c3c-red转染肝癌细胞株Huh7细胞，转染后48h用荧光显微镜观察，如附图6所示，重组乙肝病毒中携带的外源基因编码的红色荧光蛋白可以有效表达。实施例3 :检测重组病毒颗粒的完整性
用重组人乙肝病毒载体基因组的表达质粒PHY-5c3c、带有Tat蛋白基因的重组乙肝病毒基因组的表达质粒PHY-5c3c-Tat与乙肝表面蛋白表达质粒sp-s共同转染肝癌细胞株Huh7细胞，转染后72h收集细胞上清，用抗PreSl(位于大表面蛋白的氨基端)的抗体做pulldown实验，并利用核酸杂交的方法检测pull down的重组乙肝病毒是否包含病毒DNA。用单转PHY-5c3c和PHY-5c3c-Tat的细胞上清作为阴性对照，用转染PWT的细胞上清作为阳 性对照。如图7所示，不论是否与sp-s共转，重组病毒均能复制，但只有在反式提供表面蛋白的情况下，才能形成可以被PreSl抗体pull down的完整病毒颗粒。综合上述，本发明的重组人乙肝病毒载体能使插入的外源基因表达，重组乙肝病毒可高效复制，并在提供表面蛋白的情况下形成完整的重组乙肝病毒颗粒，表明本发明的重组人乙肝病毒载体作为肝脏特异性的基因导入载体的应用前景。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。


本发明属于医药及基因工程领域，涉及一种基于人乙型肝炎病毒的重组载体，该病毒基因组相对于野生型乙型肝炎病毒载体，缺失乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或者全部。本发明还提供了该重组载体的制备方法及其在靶向肝脏或者肝细胞的基因治疗方面的应用。本发明的人乙肝病毒重组载体能使插入的外源基因表达，重组乙肝病毒可高效复制，并在提供表面蛋白的情况下形成完整的重组乙肝病毒颗粒，表明本发明的重组人乙肝病毒载体作为肝脏特异性的基因导入载体的应用前景。