专利名称：眼镜蛇长链神经毒素在制备毒蕈碱型m4受体激活剂方面的应用的制作方法蛇毒是蛇毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。蛇毒的干物质中90%以上是蛋 白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分可通经络， 祛风湿，并具有强身健体之功效，早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼 痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道，后者在镇痛 中具有依赖性，是困惑临床治疗的一大难题。眼镜蛇长链神经毒素(α -cobratoxin, α -CbTX)是一种提纯自泰国眼镜蛇(Naja naja kaouthia)的突触后长链神经毒素，含有71个氨基酸和5个二硫键，其分子量为7803 左右。氨基酸序列为IRCFITPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPTVKTGVDIQCC STDNCNPFPTRKRP。一系列报道表明，眼镜蛇长链神经毒素(α-CbTX)具有神经调节、免疫抑 制、抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用。之前的研究表明，眼镜蛇长链神经毒素(α-CbTX)具有明 确的镇痛效果，临床应用无成瘾性和耐药性，且作用比吗啡持久，可作为新的疼痛治疗的药 物。但是，到目前为止，其产生镇痛作用的靶点还不清楚。在大多数报道中，眼镜蛇长链神 经毒素(a-CbTX)高亲和力结合a 7N型胆碱受体，并作为工具药来鉴定不同的N受体亚 型。但是，近来的研究表明，M受体拮抗剂阿托品可以阻断眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX) 的镇痛作用，而运用电生理方法也证明了这点，说明M胆碱受体参与了眼镜蛇长链神经毒 素(a-CbTX)的镇痛作用机制。但究竟是哪种胆碱受体及其受体亚型目前并无任何报道。
本发明目的在于提供一种眼镜蛇长链神经毒素(a -cobratoxin, α -CbTX)在制 备毒蕈碱型Μ4受体激活剂方面的应用，提供了一种新型的药物镇痛靶点，同时眼镜蛇长链 神经毒素(a-CbTX)作为配体通过激活Μ4受体发挥疼痛中作用。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX)在制备毒蕈碱型Μ4受体激活剂方面的应用。优选的，所述毒蕈碱型Μ4受体激活剂通过激活Μ4受体依赖的PTX敏感的PKA信 号通路抑制T型钙电流来发挥镇痛作用。本发明的技术方案揭示了一种眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX)通过Μ4受体发挥 镇痛作用，眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX)是从泰国眼镜蛇蛇毒中提纯的神经毒素。由于 本发明的揭示眼镜蛇长链神经毒素通过激活Μ4受体依赖的T型钙电流产生镇痛作用，可 以构建包含眼镜蛇长链神经毒素的毒蕈碱型Μ4受体激活剂来进行临床镇痛的应用。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是本发明揭示了眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX)通过激活毒蕈碱型Μ4受体发挥镇 痛作用，提供了一种外周镇痛的新靶点，即将Μ4受体可作为外周镇痛的新靶点应用于临 床。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为小鼠背根神经节内存在毒蕈碱型胆碱M1R，M2R，M3R及M4R受体的表达；图2为眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX)对小鼠热痛、机械痛和炎症痛具有抑制作 用；图3为眼镜蛇长链神经毒素(ci-CbTX)对小鼠小直径背根神经元T型钙电流的影 响；图4为通过M受体拮抗剂和阿片受体拮抗剂进行阻断相关受体来检测眼镜蛇长链 神经毒素(α -CbTX)的镇痛机理；图5为通过不同亚型的M受体拮抗剂进行阻断相关受体来检测发挥眼镜蛇长链神 经毒素(α -CbTX)镇痛机理的M受体亚型。
取小鼠40只，体重18 22g，随机分4组，每组10只，分别生理盐水组，长链神经毒 素(a-CbTX) (5yg/kg)剂量组。用微量注射器在鞘内注射穿刺给药。实施例通过热板法， von Frey法、福尔马林法和醋酸扭体法测定鞘内注射眼镜蛇长链神经毒素(α-CbTX)对小 鼠热痛、机械痛和炎症痛的影响。如图2所示为眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX)对小鼠热 痛、机械痛和炎症痛具有抑制作用的结果。结果显示，与生理盐水对照组相比，鞘内注射眼 镜蛇长链神经毒素(a-CbTX，5yg/kg)对这三种痛都具有明显的镇痛作用，而a-CbTX的 镇痛作用能被静脉注射Μ4受体拮抗剂托吡卡胺(t0picamide，5mg/kg)阻断，表明α-CbTX 通过Μ4受体发挥镇痛作用。图2中，A为采用热板法测定眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX) 对小鼠镇痛作用的影响。B为采用von Frey法测定眼镜蛇长链神经毒素(α-CbTX)对小鼠 镇痛作用的影响。C为采用福尔马林法测定眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX)对小鼠镇痛作 用的影响。D为采用醋酸扭体法测定眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX)对小鼠镇痛作用的影 响。3)眼镜蛇长链神经毒素通过胆碱Μ4受体抑制T型钙通道实验材料昆明种小鼠，体重18_22g，由苏州动物中心提供，动物合格证号 SYXK(苏)2007-0035。实验方案显微外科取DRG，酶法分离DRG神经元，应用全细胞膜片钳记录小直径DRG神经元 T型钙离子通道电流，每组记录8-10个细胞。实施例检测了眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX) 对小鼠小直径背根神经元T型钙电流的影响。结果如图3所示。结果表明，该抑制作用并 不是由于T型钙通道本身的衰减而引起.全细胞膜片钳结果表明，α-CbTX能够抑制小直 径DRG神经元T型钙电流，并具有剂量依赖性。半数有效量为0. 17 μ Μ。实施例通过M受体拮抗剂和阿片受体拮抗剂进行阻断相关受体来检测眼镜蛇长 链神经毒素(a-CbTX)的镇痛机理。如图4所示，眼镜蛇长链神经毒素(a-CbTX)通过M 受体抑制T型钙电流.M受体拮抗剂阿托品(atropine，1 μ Μ)和东莨菪碱(scopolamine， 1 μ Μ)能够阻断眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX, 0. 5 μ Μ)对T型钙通道的抑制(抑制率％ =3. 8士 1.5，η = 6 ；抑制率％= 3. 2士 1. Ln = 6)，而阿片受体拮抗剂纳洛酮(naloxone， ΙμΜ)则不能(抑制率％= 22.0士 1.7，η = 6)。此结果表明M受体而非阿片受体参与 α -CbTX对T型钙电流的抑制。图4中〃* P < 0. 001，与对照组相比。实施例通过不同亚型的M受体拮抗剂进行阻断相关受体来检测发挥眼镜蛇长链 神经毒素(α -CbTX)镇痛机理的M受体亚型。如图5所示，眼镜蛇长链神经毒素(α -CbTX) 通过Μ4受体抑制T型钙电流.选择性Ml受体拮抗剂哌仑西平(pirenze pine，1 μ Μ)，M2受 体拮抗剂美索曲明(methoctramine，200nM)和M3受体拮抗剂4-DAMP (1 μ Μ)对眼镜蛇长链 神经毒素(a -CbTX，0. 5μΜ)对T型钙电流的抑制作用无影响，抑制率分别为21. 7士 1. 5% (n = 6)，22. 1 士 2. 2% (n = 7)和22. 6 士 1.8% (n = 7)。而选择性Μ4受体拮抗剂托吡卡 胺(tropicamideayM)阻断了此抑制作用(抑制率％ = 3. 9士 1. 4，η = 8)。此结果表明 Μ4受体参与α -CbTX对T型钙电流的抑制。图5中〃* P < 0. 001，与对照组相比。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。


本发明公开了一种眼镜蛇长链神经毒素(α-cobratoxin，α-CbTX)在制备毒蕈碱型M4受体激活剂方面的应用。该神经毒素通过激活M4受体依赖的T型钙电流产生镇痛作用，可以构建包含眼镜蛇长链神经毒素的毒蕈碱型M4受体激活剂来进行临床镇痛的应用。