使用RNA依赖性核酸修饰酶检测mRNA与寡核苷酸阵列的结合制作方法

彼得·埃斯蒂贝罗, 彼得 埃斯蒂贝罗

2004年11月17日

2002年3月7日

2001年3月8日

埃克斯普拉松生物系统有限公司

C12N15/09GK1547614SQ02808495

RNA 修饰 依赖性 核酸 检测 使用

1.通过描绘RNA转录物而用于测定天然RNA的结构参数的装置，所述装置包括具有呈现在表面载体上的固定化寡核苷酸的阵列，其中所呈现的寡核苷酸在其自由3’端具有活性OH基，以及延伸所述3’-OH基的工具，所述工具依赖于特定的固定化寡核苷酸和所施加的RNA之间互补的碱基对相互作用2.如权利要求1所述的装置，其进一步包括检测所述固定化延伸产物的工具3.如权利要求1或2所述的用于描绘RNA转录物的装置，其中寡核苷酸的一个特定长度或多个长度的任意或所有可能组合呈现在阵列的表面上4.如前述权利要求之任一项所述的装置，其中长度为6～8或9～15个核苷酸的寡核苷酸的所有可能组合呈现在阵列上5.如前述权利要求之任一项所述的装置，其中寡核苷酸呈现在阵列上物理分离的多个位置上6.如前述权利要求之任一项所述的装置，其中寡核苷酸通过在5’端的化学修饰而被锚定在阵列载体上7.如前述权利要求之任一项所述的装置，其中使用常规连接技术将寡核苷酸连接到阵列上8.如权利要求7所述的装置，其中用于将寡核苷酸连接到阵列上的连接技术是氨基连接9.如权利要求8所述的装置，其中用于将寡核苷酸连接到阵列上的连接技术是生物素/链霉抗生物素蛋白连接10.如前述权利要求之任一项所述的装置，其中通过化学间隔基将寡核苷酸与载体分隔开11.如权利要求10所述的装置，其中化学间隔基的长度为6～40个碳12.如权利要求1～11所述的装置，其中通过使用多个核苷酸或核苷酸类似物延长寡核苷酸的5’端而将寡核苷酸与载体分隔开13.如权利要求10～12所述的装置，其中分隔核苷酸可以是任何天然或合成的核苷酸或核苷酸类似物，并且可以是均聚物或杂聚物14.通过检测天然RNA和寡核苷酸阵列的结合而测定所述天然RNA的结构参数的方法，其中应用以下步骤(a)将天然RNA施加到阵列上，并使之退火于与所述天然RNA内的可及序列互补的寡核苷酸；(b)施加RNA依赖性核酸修饰酶，并进行反应；以及(c)将任何未结合的RNA或酶或其它反应成分洗去；以及(d)检测由RNA依赖性修饰酶引起的修饰15.如权利要求14所述的方法，其中任何或所有步骤(a)、(b)、(c)和(d)同时或顺序发生16.如权利要求14或15所述的方法，其中直接检测由RNA依赖性修饰酶引起的一种或多种修饰17.如权利要求14或15所述的方法，其中间接检测由RNA依赖性修饰酶引起的一种或多种修饰18.如权利要求14～17所述的方法，其中RNA依赖性核酸修饰酶是RNA依赖性DNA聚合酶19.如权利要求18所述的方法，其中RNA依赖性DNA聚合酶是具有逆转录酶活性的酶20.如权利要求19所述的方法，其中可以将具有逆转录酶活性的酶修饰成缺乏核糖核酸酶H活性的逆转录酶21.如权利要求14～20之任一项所述的方法，其中当将mRNA施加于阵列上时使用反应缓冲液22.如权利要求21所述的方法，其中反应缓冲液与酶活性相容，也与RNA二级和三级结构的保持相容，并与所施加的RNA和阵列上的互补寡核苷酸元素之间的双链体形成相容23.如权利要求14～22之任一项所述的方法，其中将体积排除器加入反应混合物中24.如权利要求23所述的方法，其中体积排除器是聚乙二醇(PEG)25.如权利要求23所述的方法，其中体积排除器是硫酸葡聚糖26.如权利要求14～25之任一项所述的方法，其中将标记的脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和RNA依赖性核酸修饰酶一起施加于阵列以检测双链体27.如权利要求14～25所述的方法，其中可以将标记的二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)和RNA依赖性核酸修饰酶一起加入以检测双链体28.如权利要求26或27所述的方法，其中可以通过荧光、无机发光材料成像或放射自显影检测标记的dNTPs或标记的ddNTPs29.如权利要求14～25所述的方法，其中如下检测双链体将未标记的ddNTPs和RNA依赖性核酸修饰酶一起加入阵列中，洗去未反应的过量ddNTPs，加入具有标记的dNTPs的适宜缓冲液中的末端转移酶，以使未成为被标记的固定化寡核苷酸是与先前施加的靶RNA的可及序列互补的那些30.如权利要求14～29所述的方法，其中阵列是如权利要求1～13所述的装置

本发明涉及检测mRNA与阵列上的寡核苷酸的结合的方法，其中使用RNA依赖性核酸修饰酶检测mRNA的结合反义，作为为研究或治疗目的而控制基因表达的工具，在七十年代首次得到描述从那时起，已将很多努力付诸于理解反义是如何工作的，和付诸于开发描绘有效的反义靶的方法反义通过将与靶mRNA互补的短的合成核酸，反义试剂引入细胞中而工作反义试剂结合到其靶mRNA上，并阻止翻译，认为阻止翻译的机理包括通过内源核酸酶标记降解以及转录或翻译的物理阻碍反义试剂的设计由于mRNA具有极其复杂的二级和三级结构的事实而变得复杂在分子的二级和三级结构内的分子内相互作用涉及任何给定的mRNA的核苷酸序列的至少90％，因此它们不能参与其和反义试剂的分子间相互作用设计成功的反义试剂的关键是识别能参与分子间杂交的可能mRNA靶的有限区域特异性靶向于这些可及区的反义试剂具有在体内结合于靶mRNA的高可能性，从而有效降低其编码产物的表达水平在现有技术中有许多体外试验方法能有效用于靶向反义试剂一般而言，这些试验方法依赖于使用寡核苷酸文库来调节通过核糖核酸酶H进行的体外RNA转录物的裂解，或者结合于RNA并在凝胶电泳的过程中引起标记物种的延迟，或者结合于分离的元素的阵列上的RNA，以使来自各元素的信号能够被检测并与结合到该位置的能力相关成功的方法依赖于知道靶mRNA的序列和设计长度达二十五个核苷酸的重叠寡核苷酸的文库靶mRNA的序列呈现在寡核苷酸文库中，以使第一个寡核苷酸可以与靶mRNA的位置一至十五互补，第二个将与二至十六互补，第三个与三至十七互补，等现有技术中已经提出一些方法，其中可以使用不依赖于靶序列的先进知识的装置来设计反义试剂提出这种装置包括固定在玻璃或塑料载体上的寡核苷酸阵列，以使所有可能的序列组合由四至八个核苷酸单元的寡核苷酸呈现这种类型的装置在国际专利WO 98/15651和美国专利US 006054270中公开在该专利和专利申请中，提出各寡核苷酸物理分离在阵列上，靶mRNA杂交后，洗去未结合的物质，从结合的寡核苷酸检测信号通过了解那些序列存在，以及存在于阵列上的哪个物理上分离的位置，可以推断能够参加分子间杂交的靶mRNA的序列推断的序列可能是反义调节的基因减少(knockdown)的有效靶WO 98/15651和US 006054270都描述了包括所有可能的四至八个碱基序列组合的阵列尽管这在技术上可行，但四个碱基序列组合需要256个元素在阵列上以呈现所有序列组合，八个碱基序列组合需要65536个元素在阵列上以呈现所有序列组合，使用这样短的四至八个碱基寡核苷酸作为阵列的基础存在一些困难使用短的四至八个碱基寡核苷酸作为阵列的基础来描绘RNA结构并定义有效反义靶的区域的困难是，在杂交条件下，阵列上的寡核苷酸和施加给它的标记的转录物之间的相互作用很弱在正常的洗涤条件下，转录物被洗去，而检测不到信号可以通过使用化学间隔基将短寡核苷酸阵列元素与阵列的基板隔开而改善这种情况提高盐浓度或降低温度倾向于增加非特异性背景，但并不提高信号专利申请WO 98/15651中证实，通过将RNA杂交于四碱基寡核苷酸可以检测信号然而，在所述方案中的条件下，需要将RNA而不是寡核苷酸固定在固体载体上，并且在溶液中将寡核苷酸施加于变性的RNA在这些条件下，RNA不可能折叠成其体内结构的真正代表，所阐述的方法不会以适于靶向反义的方式描绘RNA的结构简而言之，在RNA浓度足以驱动杂交反应有利于形成双链体的条件下，固定化寡核苷酸将杂交到全长RNA转录物上在正常洗涤条件下，例如1M NaCl，4℃～30℃之间，与稀释所施加的RNA相关的动力学改变一般有利于短双链体的熔化分开，这样真正的相互作用，用信号表示RNA的区域可能对反义调节减少而言是可及的，不能被直接检测到通常，为了获得描绘被折叠成其体内结构真正代表的RNA结构的一致性和条件，需要使用长度至少为十个核苷酸的寡核苷酸长度为十个核苷酸的寡核苷酸的完全简并阵列将包含多于一百万的元素并且将非常昂贵因此，可以看出需要能够检测RNA和长度小于十个核苷酸的寡核苷酸组合文库的成员间的相互作用的方法本发明的第一个目的是提供检测天然体外RNA转录物和固定在固体载体上的短寡核苷酸间的杂交的方法本发明的另一目的是提供使用由代表寡核苷酸的特定长度或多个长度的所有可能组合的达100000个单个元素组成的中等密度寡核苷酸阵列来描绘任何mRNA上的可及区的工具作为实现描绘阵列的基础，还可能使用特定或可变的一个或多个长度的完全简并寡核苷酸文库，每个寡核苷酸被物理分离在溶液中，以使每个溶液中的寡核苷酸序列已知可以根据序列选择所述寡核苷酸的亚类或全部并用于印出与所感兴趣的靶RNA互补的序列寡核苷酸的所述亚类的选择和印出可以通过计算机控制的装置进行本发明的再一目的是提供用于直接检测双链体的方法本发明的再一目的是提供间接检测RNA和寡核苷酸间形成的双链体的方法根据本发明，提供了通过描绘RNA转录物而用于测定天然RNA的结构参数的装置，所述装置包括具有呈现在其表面载体上的固定化寡核苷酸的阵列，其中所呈现的寡核苷酸在其自由3’端具有活性OH基，以及延伸所述-OH基的工具，所述工具依赖于特定的固定化寡核苷酸和所施加的RNA之间互补的碱基对相互作用优选地，该装置进一步包括检测所述固定化延伸产物的工具优选地，寡核苷酸的一个特定长度或多个长度的所有可能组合呈现在该阵列的表面上更优选地，长度为六至八或九至十五个核苷酸的寡核苷酸的所有可能组合呈现在该阵列上物理分离的多个位置上最优选地，六至八个碱基的寡核苷酸的所有可能组合呈现在该阵列上物理分离的多个位置上任选地，阵列由塑料制成另外的选择是阵列由玻璃制成本发明并不受制作阵列的材料的限制优选地，寡核苷酸通过在5’端的化学修饰而被锚定在阵列载体上优选地，使用常规连接技术将寡核苷酸连接到阵列上任选地，用于将寡核苷酸连接到阵列上的连接技术是氨基连接用于将寡核苷酸连接到阵列上的另一选择是生物素/链霉抗生物素蛋白连接的使用本发明并不受用于将寡核苷酸连接到阵列上的连接技术的限制任选地，通过化学间隔基将寡核苷酸与载体分隔开优选地，化学间隔基的长度为6～40个碳可以通过使用多个核苷酸或核苷酸类似物延长寡核苷酸的5’端而将寡核苷酸的特定序列与阵列分隔开例如可以通过使六碱基序列5’CGGAAC3’成为5’AAAAAAAAAAACGGAAC3’而将其与阵列分隔开分隔核苷酸可以是任何天然或合成的核苷酸或核苷酸类似物，并且可以是均聚物或杂聚物本文中的核苷酸还意指脱氧核苷酸或任何修饰的核苷酸或脱氧核苷酸核苷酸间隔基可以与化学间隔基一起使用根据本发明的第二个方面，提供了通过检测天然RNA和如在第一方面中描述的寡核苷酸阵列的结合而测定所述天然RNA的结构参数的方法，其中(a)将天然RNA施加到阵列上，并使之退火于与所述天然RNA内的可及序列互补的寡核苷酸；(b)施加RNA依赖性核酸修饰酶，并进行反应；以及(c)将任何未结合的RNA或酶或其它反应成分洗去；以及(d)直接或间接检测由RNA依赖性修饰酶引起的修饰优选地，任何或所有步骤(a)、(b)、(c)和(d)同时或顺序发生优选地，RNA依赖性核酸修饰酶是RNA依赖性DNA聚合酶最优选地，RNA依赖性DNA聚合酶是具有逆转录酶活性的酶可以将具有逆转录酶活性的酶修饰成缺乏核糖核酸酶H活性的逆转录酶优选地，当将mRNA施加于阵列上时使用反应缓冲液最优选地，反应缓冲液与酶活性相容，也与RNA二级和三级结构的保持相容，并与所施加的RNA和阵列上的互补寡核苷酸元素之间的双链体形成相容任选地，将体积排除器加入反应混合物中任选地，体积排除器可以是聚乙二醇(PEG)另一选择是体积排除器是硫酸葡聚糖任选地，将标记的脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和RNA依赖性核酸修饰酶一起施加于阵列以直接检测双链体或者，可以将标记的二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)和RNA依赖性核酸修饰酶一起加入以直接检测双链体任选地，可以通过荧光、无机发光材料成像(phosphorimaging)或放射自显影检测标记的dNTPs或标记的ddNTPs任选地，可以如下间接检测双链体将未标记的ddNTPs和RNA依赖性核酸修饰酶一起加入阵列中，洗去未反应的过量ddNTPs，加入具有标记的dNTPs的适宜缓冲液中的末端转移酶，其中未成为被标记的固定化寡核苷酸是与先前施加的靶RNA的可及序列互补的那些为了更好地理解本发明，现在将仅通过实施例的方式描述本发明的实施方案在本发明的第一个方面，提供了用于描绘RNA转录物和测定对于反义调节的基因减少(knockdown)而言可能是有效的靶的区域的装置该装置包括优选具有呈现于阵列上物理分离的位置上的寡核苷酸的一个特定长度或多个长度的所有可能组合的阵列该寡核苷酸通过在其5’端的化学修饰而被锚定在固体载体上，从而它们具有自由的活性3’OH基该装置还具有延长所述3’OH基的工具，所述工具依赖于特定的固定化寡核苷酸和所施加的RNA之间的互补碱基对相互作用可以使寡核苷酸固定在阵列表面上的化学修饰通常为连接基团的添加的形式虽然生物素/链霉抗生物素蛋白连接和其它连接技术同样是可以应用于本发明的常规使用的技术，但是一般使用氨基连接的寡核苷酸在RNA的浓度足以驱动杂交反应动力学有利于形成双链体的条件下，寡核苷酸的亚群将杂交到任何所施加的RNA上根据本发明的第二个方面，上述阵列装置可以用于检测未标记的mRNA与阵列上的寡核苷酸亚类的结合在初生态RNA可以其体内结构的真正代表的方式折叠的条件下，在体外从全长或部分cDNA克隆转录靶mRNA的拷贝一旦合成，将靶mRNA保持在将保持其真正的二级和三级结构的条件下在允许真正折叠的条件下，体外转录靶RNA并将其施加于阵列所施加的RNA的高浓度驱动该RNA和阵列上那些与RNA的可及区互补的寡核苷酸之间的杂交反应动力学向双链体形成的方向发展由于固定化寡核苷酸的取向，这样形成的双链体是RNA依赖性DNA修饰酶如逆转录酶的底物特别地，诸如AMV-逆转录酶或M-MuLV逆转录酶的酶是适宜的也可以使用经设计而停止其核糖核酸酶H活性的逆转录酶，如Expand RT(Roche)或M-MuLVRNaseH-(Promega)一般而言，将RNA在反应缓冲液中施加于阵列，所述反应缓冲液与酶活性相容，也与RNA二级和三级结构的保持相容，并且支持所施加的RNA和固定在阵列上的互补寡核苷酸元素之间的双链体形成通常，反应缓冲液可以包含50mM Tris-Cl、5～10mMMgCl2、25～50mM KCl、1～10mM DTT，pH约为8.5可以加入体积排除器，如约6％w/v的聚乙二醇(PEG)或30％w/v的硫酸葡聚糖这些体积排除器用于提高反应成分的表观浓度，并且可能对双链体形成的动力学具有有利影响由于那时形成的RNA/DNA杂双链体现在是RNA依赖性DNA聚合酶，如逆转录酶的底物，逆转录酶现在可以用于修饰杂交寡核苷酸的自由3’OH基，并由此将其标记以进行检测通过随后检测阵列上的修饰的寡核苷酸，可以推断它们能够与之杂交的序列，因此推断所施加的RNA转录物的可及区通过对阵列上寡核苷酸亚类的酶促修饰的直接或间接解释推断相互作用双链体的直接检测如所讨论的，将适宜缓冲液中的RNA施加于序列，并使之杂交到与其可及区互补的寡核苷酸的亚类上将逆转录酶施加到杂交的阵列上，并于4℃～65℃温育几分钟还加入标记的脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)在这些条件下，逆转录酶将把标记的dNTPs加到任何杂交的寡核苷酸的自由3’OH基上标记可以是放射性的或发荧光的，或者可以是可以随后通过其它标准方法测定的表位、化学标记或酶使用适宜的洗涤缓冲液，如100mM NaCl，0.1％SDS洗去RNA、酶和任何过量的标记的dNTPs然后，那些已加上标记的dNTPs的寡核苷酸可以通过适宜的方法，如荧光、无机发光材料成像或放射自显影得到检测从标记的寡核苷酸在阵列上的位置可以了解序列，并可以推断所施加的RNA上互补的可及序列也可以将标记的二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)用于双链体的直接检测，在这种情况下逆转录酶将把一个ddNTP加到杂交的寡核苷酸的自由3’OH基上，这与前一实施例中的dNTP相反当使用dNTPs时，检测也以同样方式进行双链体的间接检测如前所述，将RNA施加到阵列上，并通过加入一个未标记的ddNTP而将逆转录酶用于修饰杂交的寡核苷酸的三个3’OH基洗去RNA、酶和过量的ddNTPs，然后通过在末端转移酶缓冲液中洗涤两次而平衡阵列将末端转移酶和放射标记或荧光或其它方式标记的dNTPs施加到末端转移酶缓冲液中的阵列上，并进行温育一般而言，于37℃温育5～30分钟通过加入dNTPs，末端转移酶可以给自由3’OH基加尾(tail)，但是这一反应通过加入未标记的ddNTP而受阻，因为这导致缺乏三个3’OH基的核酸因此，这一反应序列的结果是，具有自由3’OH基的寡核苷酸是最初未杂交到所施加的RNA上的那些，当施加末端转移酶和标记的dNTPs时，正是这些寡核苷酸被加尾杂交到所施加的RNA上的寡核苷酸通过未标记的一个ddNTP的RNA依赖性加入而得到修饰，这些寡核苷酸不能随后通过用末端转移酶的加尾而标记因此，在末端转移酶步骤期间没有被标记的固定化寡核苷酸是与所施加的靶RNA的可及序列互补的那些以上公开的实施方案仅是本发明的例示，本发明可以是不同形式的实施方案因此，本文所公开的细节并非限制性，而仅作为权利要求的基础，并教导本领域技术人员以任何适宜的方式发挥本发明的各种用途