专利名称：三种芒果象甲快速鉴定的特异性引物及其检测方法芒果在我国种植已有几百年的历史，近年来，芒果种植业迅速发展，已在云南、海南、广西、广东、福建等地大面积种植，成为热带的主要水果之一，同时也可作为城市绿化的主要树种。芒果象甲类Mernochetus spp.是芒果生产栽培中危险性的害虫。芒果象甲隶属于鞘翅目Coleoptera，象虫科Curculionidae,隐喙象亚科Cryptorhynchinae, 洞腹象属Mernochetus。该属有3种象甲可危害果，其中危害果核的有芒果果核象甲 (S. mangiferae Fabricius)和芒果果实象甲(S. olivieri Faust)；危害果肉的有芒果果肉象甲(S. frigidus Fabricius)，它们都是芒果的主要害虫，已被我国列为对外进境植物检疫二类危险性的害虫，能使芒果被害率达30-80%，严重影响了芒果的产量和品质。随着我国对外贸易交往日益频繁，芒果象甲随水果进入的机率大大增加，为防止其对芒果产业再次造成巨大的经济损失，有效地避免芒果象甲随入境果进入传播、扩散和危害，加强对三种象甲的识别鉴定与检疫尤为重要。目前，对芒果象甲的鉴定主要从体形大小、触角形态及构造、前胸背板中隆线的明显与否、鞘翅斜带的宽窄、奇数行间鳞片瘤的大小和有无等特征为依据。但传统的方法很难对芒果象甲的幼虫或残缺个体进行鉴别。近年来分子生物学技术发展迅速，基于PCR技术的分子鉴定为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态鉴定的诸多不足。利用分子标记鉴定物种已有不少的尝试，如Ward等Q005)完成了对澳大利亚207种鱼类的分子编码，同年，Ball和Hebert Q005)尝试用分子条码鉴定70多种水生昆虫蜉蝣(蜉蝣目， Ephemeroptera)。PCR技术以生物基因组DNA为检测依据，具有检测周期短和不受靶物种的形态、性状等方面影响的优点，非常适合芒果象甲等一些检疫性害虫未成熟虫态的快速检疫鉴定。本文通过对三种芒果象甲基因序列的分析，设计并筛选出了能特异性扩增三种芒果象甲基因片段的引物，完成了对三种芒果象甲的PCR快速准确鉴定。
本发明的目的是针对从形态上难以鉴定的三种芒果象甲，利用分子标记手段，分别设计三种象甲的特异性引物，创建了高度准确可靠、易于操作的芒果象甲的检测和快速鉴定方法。该方法可以直接应用于生产实践，对于芒果象甲的鉴定和检疫具有十分重要的眉、ο本发明的技术方案如下1.提取三种芒果象甲的基因组DNA，利用 hternal Transcribed Spacer Regions I(ITSl)通用引物进行PCR扩增，通过克隆测序得到三种芒果象甲的ITSl序列。2.对获得的三种芒果象甲的序列进行比对分析，分别找到三种芒果象甲的特异区域，利用Oligo 6.0软件，在这些区域设计三种芒果象甲的特异引物。3.对新设计的特异引物进行温度、Mg2+等条件的优化，使之能更加准确的扩增出目的片段。从而达到快速，准确鉴定三种芒果象甲的目的。4.对扩增出的目的片段进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA Marker-DL2000检测 PCR片段大小。5.鉴定结果的判断根据电泳显示的PCR扩增片段的大小来判断，若有明显清晰的370bp左右的条带，则可判断为是芒果果肉象甲，若条带为790bp左右的为芒果果核象甲，若条带为210bp左右的则为芒果果实象甲。本发明的效果是结合PCR技术手段的鉴定方法，可以给非传统分类的专业人士， 提供准确快速鉴定三种芒果象甲的技术，从而为芒果象甲的防治以及检疫做出贡献。图1为用SF-F/SF-R特异性引物鉴别芒果果肉象甲结果，其中M为DNA Marker, XI，X2，X3 为芒果果肉象甲 S. frigidus X4，X5，X6 为芒果果核象甲 S. mangiferae ；X7, X8， X9为芒果果实象甲S. Olivieri0图2为用S0-F/S0-R特异性引物鉴别芒果果实象甲结果，其中M为DNA Marker, XI，X2，X3 为芒果果肉象甲 S. frigidus ；X4, X5，X6 为芒果果核象甲 S. mangi ferae ；X7, X8， X9为芒果果实象甲S. Olivieri0图3为用SM-F/SM-R特异性引物鉴别芒果果核象甲结果，其中M为DNA Marker, XI，X2，X3 为芒果果肉象甲 S. frigidus ；X4, X5，X6 为芒果果核象甲 S. mangi ferae ；X7, X8， X9为芒果果实象甲S. Olivieri0
3. PCR反应的电泳检测取上述反应液5 μ 1与1 μ 1载样缓冲液混合，用1. 2%的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行拍摄检测。4.鉴定结果的判断根据电泳显示的PCR扩增片段的大小来判断，若有明显清晰的370bp左右的条带，则可判断为是芒果果肉象甲，若条带为790bp左右的为芒果果核象甲，若条带为210bp左右的则为芒果果实象甲。


本发明属于应用生物技术领域，本发明针对三种形态相似的危险性害虫-芒果象甲，提供了一套快速鉴定的专用引物及其使用方法。本发明设计的三对特异性引物可以分别用来鉴定三种芒果象甲，本发明针对于不同的芒果象甲设计不同的特异性引物，能准确而快速地鉴别三种芒果象甲，该方法操作简便快捷，具有广泛的适用性。本发明为芒果象甲的防治与检疫提供了重要的参考依据，具有重要的理论意义和实用价值。