作为新填料的粘弹性凝胶制作方法

D·雷尼尔, M·戴斯特

2012年7月4日

2010年8月25日

2009年8月27日

菲迪雅制药股份公司

A61L27/26GK102548590SQ201080037756

粘弹性 填料 凝胶 作为

1.生物材料，其可以如下获得以10 90至90 10的重量比混合 -透明质酸的自动交联衍生物(ACP)与-与1，4_ 丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)交联的透明质酸的衍生物(HBC)，作为新填料和 /或作为形体塑造产品2.生物材料，其可以如下获得以10 90至90 10的重量比混合 -透明质酸十六烷基酰胺(HYADD)与-与1，4_ 丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)交联的透明质酸的衍生物(HBC)，作为新填料和 /或作为形体塑造产品3.权利要求1-2所述的生物材料，优选地以90 10至50 50的重量比，作为生物再生填料4.权利要求1-2所述的生物材料，以10 90至50 50的重量比，具有体积增强效应5.权利要求4所述的生物材料，优选地为25 75的重量比6.用于制备和纯化HBC衍生物的方法，包括以下步骤a.在二环氧化物BDDE的碱性溶液中以2.5%至25%的摩尔化学计量比溶解透明质酸的重复单位，然后b.在室温，在a)中所述的溶液中分散透明质酸(HA)；c.通过加热激活引发反应，将b)中所述溶液在35°C至55°C的温度加热2小时至36小时；d.通过金属筛挤压获得的团块，以降低其至大约600μ m大小的颗粒；e.以3至20的倍数将其用水稀释，水合所得到的凝胶；f.用HCl水溶液校正pH至中性；g.用水溶性有机溶剂如乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、二巧憑烷、乙腈、丙酮和/或它们的混合物沉淀，直到获得粉末形式的产物；h.用含水的有机溶剂如乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、二，悉烷、乙腈、丙酮和/或它们的混合物洗涤；i.在真空下干燥，直到已将残留溶剂去除在400ppm以下，并获得HBC粉末7.混合ACP或HYADD与如权利要求6中所述制备的HBC的方法，包括以下步骤a.将ACP或HYADD粉末与HBC粉末以90 10至10 90的ACP或HYADD HBC的比率混合；b.用盐水溶液或磷酸盐缓冲液水合，使总HA浓度为12mg/ml至27mg/ml；c.在25°C至65°C的温度、通过具有50μ m至500 μ m筛孔的筛挤压；d.充填注射器；e.用饱和蒸汽在120至的温度、通过加热灭菌至少10分钟8.制备和纯化HBC衍生物的方法，包括以下步骤a.在二环氧化物BDDE的碱性溶液中以2.5%至25%的摩尔化学计量比溶解透明质酸的重复单位，然后b.在室温，在a)中所述的溶液中分散HA;c.通过加热激活引发反应，将b)中所述溶液在35°C至55°C的温度加热2小时至36小时；d.用HCl水溶液校正pH至中性；e.以3至20的倍数将其用水稀释，水合所得到的凝胶9.混合ACP或HYADD与如权利要求8中所述制备的HBC的方法，包括以下步骤a.将ACP或HYADD凝胶或粉末与凝胶形式的HBC以90 10至10 90的ACP或 HYADD HBC的比率混合；b.通过25μ m至150 μ m颗粒物质保留系数的滤器，粉碎并均一化；c.充填注射器；d.用饱和蒸汽在120至的温度加热灭菌至少10分钟10.权利要求6-9所述的方法，其中用于制备HBC、ACP和HYADD衍生物的HA具有平均分子量为400至3 X IO6Da,优选地1 X IO5Da至1 X IO6Da,和更优选地200，000至1 X IO6Da011.如权利要求8-9所述获得的生物材料，其中所述ACP HBC重量比为25 7512.前述权利要求所述的生物材料，其中所述赋形剂是盐溶液13.前述权利要求所述的生物材料，其含有利多卡因14.权利要求11所述的生物材料，其含有利多卡因，其中所述赋形剂由盐溶液组成15.前述权利要求所述的生物材料作为新填料和/或作为新形体塑造产品在处理皮肤瑕疵中、在皮肤病学中、在皮肤美容学中和/或在美容外科中的用途

透明质酸(HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的交替残基组成的杂多糖取决于其获自的来源和所使用的制备方法，HA是具有50，000至13 X IO6Da分子量范围的直链聚合物HA天然存在于细胞外周胶质中、脊椎动物的结缔组织的基质中(其是主要组分之一)、玻璃体液中和脐带中HA在生物有机体中起着重要的作用，作为组织的结构和机械支持物，并在细胞生理组织如皮肤、肌腱、肌肉和软骨中作为活性组分它是软骨基质的主要分子之一，还代表了滑液的主要非蛋白质构成部分由于它是较强的亲水性粘弹分子，因此其赋予了滑液以润滑剂特性；HA因此已用于骨关节炎超过 30年，主要用于治疗相关的疼痛根据构造学观点，HA还在组织修复过程中(在组织胞外基质的构造和调节其水合中)发挥着关键作用，并作为其中所述多糖直接或间接发挥作用的许多生理过程(血块形成、吞噬细胞活性、成纤维细胞增殖、新血管形成、再上皮化等等)的刺激/调节物质 (Weigel P.等人，J Theoretical Biol, 1986 219-234 ；Abatangelo G.等人，J Surg Res, 1983,35 =410-416 ；Goa K.等人，Drugs, 1994,47 536-566)由于这些特性是长期公认的， 所以还将HA用于制备护理多种来源的伤口、溃疡和皮肤损伤的敷料透明质酸还用作脸部皱纹、沟和小凹陷部位的填料，并且用于增加嘴唇和脸颊的体积，因为其免疫学惰性、无毒性、生物可降解和生物可再吸收基于透明质酸的处理旨在校正 嘴唇体积和轮廓 沟(例如鼻唇沟) 面部轮廓(例如脸颊和下巴)的重塑 皱纹(例如眉间线和口连合) 眶周皱纹 纤维性痤疮后疤痕 纤维性创伤后疤痕 软组织瑕疵 鼻成形术疤痕透明质酸并非永久性填料这意味着，一旦注射，根据所处理的部位和所使用制剂的类型，该产品被身体以不同的时间逐渐代谢和再吸收填充和增加的体积(或者弱化的皱纹)的效果是立竿见影的，并且仅持续数周基于它们不同的再吸收时间，市售的主要产品可以划分为以下种类 快速再吸收填料个月) 中期再吸收填料(5-6个月)， 缓慢再吸收填料(1 年)例如 Restylane Sub Q(QMed, EP0839159)在真皮中，由于HA结合水的大容量，HA发挥着水合作用，并且作为“支架”发挥结构功能，因为通过与其他物质结合，其形成了使得皮肤紧凑的大分子复合物因此，作用机制由以下组成由于产物的粘弹性特性所致的即刻体积填充，和由于刺激皮肤成纤维细胞所致的新胶原合成然而，HA是天然多糖，其被结缔组织中存在的透明质酸酶快速分解；为了获得作用持续数月的填料，因此对HA进行交联过程，这改进其粘弹特性并增加其停留时间由此形成的填料例如通过bdde(i，4-丁二醇二环氧甘油醚，Restylane 、BELOTERO 和Regenyal Idea)或DVS (双乙烯砜，Hylaform )，其在聚合物分子之间产生了桥接 然而，增加交联程度会逐渐使HA变性到显著改变其化学、物理和生物学特性的程度过分交联的HA基块表现为颗粒固体，其不再被细胞(和尤其被免疫系统)识别为HA;因此，多糖被感知为异物，这会启动炎症反应，在其周围形成纤维化囊此外，过分交联的HA不能刺激由充分建立的科学结果已知的、由具有刺激皮肤成纤维细胞合成胶原作用的HA片段(特别是那些具有低分子量的HA片段)诱导的真皮/皮肤组织再生还可将填料划分为可再吸收的或永久性的可再吸收型是最生物相容的；它们由修饰的或者以天然形成存在的透明质酸或胶原组成，因此在最多一年内被再吸收永久型由合成聚合物例如聚丙烯酰胺组成，特别是交联分子，其当与水结合时形成稳定的凝胶永久型一直留在原位，对于填充嘴唇非常有用，但是并不推荐使用它们，因为由于它们的皮肤嵌入越来越多地经常引起急性炎症，导致填料周围形成纤维化囊，其被识别为异物并因此是有毒的本申请已经完成了一种新型生物材料作为新填料和/或作为形体塑造的新产品， 其通过混合以不同但是互补的方式交联的两种HA衍生物形成，以获得皮肤/组织替代物， 其允许所处理皮肤/组织的立即水合(并因此立即填充)，同时在体内维持非常长的分解时间以消除重复注射的需要，从而降低副作用本发明涉及的新生物材料表现出与透明质酸本身相同的特定生物相容特性，但是它们的生物降解性不同；当植入到体内时，它们的停留时间比未修饰的HA的停留时间更长，因此允许立即再生/重建已经丧失其原始紧实性的真皮/皮肤组织发明详述本申请已经完成了作为新填料和/或作为形体塑造新产品的一种新型生物材料， 其基于混合具有不同但互补特征的两种HA衍生物，以获得用于在处理皮肤瑕疵中、在皮肤病学中、在皮肤美容学(dermocosmetology)中和/或在美容外科中注射的新产品，其产生1.立即的真皮/皮肤水合2.所处理组织的立即填充3.非常长的体内分解时间4.降低的副作用该新生物材料的组成为·自动交联的透明质酸(ACP)或HA十六烷基酰胺(HA hexadecylamide/HYADD)， 混合有 与BDDE交联的透明质酸(HBC)如在EP 0341745中所制备的用于本发明的ACP具有4%至5%的平均交联程度， 并优选地使用平均分子量(MW)为200KDa的HA制备当水合时，其表现为自动交联凝胶， 不具有不同于天然多糖的分子，因为它产生于相同多糖链和/或邻近链的羧基和羟基之间的酯键因此，它没有免疫毒性，生物相容性与天然HA —样，高度湿润，并容易被透明质酸酶降解，释放的低分子量分子能刺激胶原合成以改进皮肤组织的紧度和弹性HA十六烷基酰胺(HYADD)如EP 1095064和EP1853279中所述制备，优选地使用平均分子量(MW)为500-730KDa的HA，最终酰胺化/替换的平均程度为1<%至3%(摩尔)ACP和HYADD是HA衍生物，其负责由真皮内注射本发明涉及的填料诱发的立即水合(导致瞬时的真皮填充)与BDDE交联的HA(含环氧基团的分子，用于在HA的伯羟基上形成醚)含有交联分子，因此对酶降解更有抗性，因为其具有稳定多糖的酯键，赋予所获得的产品更长的停留时间将两种种类的交联HA混合导致新生物材料的形成，其具有与天然透明质酸相同的生物相容性特征，但具有不同的生物降解性，以致当植入到体内时，它的停留时间比未修饰的HA更长，从而允许再生/重建已经丧失其原始紧实性的真皮组织本申请还证明，它们的结合很出乎意料地导致体内分解时间比由相同类型的HA与BDDE交联形成的市售参照填料更长，随之增加了停留时间最后，本申请要求保护新生物材料作为填料和/或作为形体塑造新产品在处理皮肤瑕疵中、在皮肤学中、在皮肤美容学中和/或在美容外科中的用途新生物材料的化学不均一性质允许通过适当改变构成部分之间的重量比来调节终产物的特性两种HA可以以10 90至90 10的ACP (或HYADD) HBC的比率混合重量比将基于所需最终粘性来选择，这取决于所处理的部位如果待处理部位需要植入大量的生物材料，如在填充乳房、臀部、脸颊或下颂或者深度表情皱纹(de印expression wrinkle)的情况下，所用的生物材料优选地表现出良好的紧实性，因此粘性适合于获得具有良好稠度和低生物降解性速率；在这种情况下，ACP (或HYADD) HBC混合物为10 90 至50 50，并且优选25 75，因为通过增加HBC的重量分数获得的产物更适合于发挥更长持续的体积增强效应然而，如果是处理唇沟或者细的前额皱纹，那么ACP(或者 HYADD) HBC的比率优选地为90 10至50 50，因为填料中较高的ACP分数产生的材料更适合于皮肤的生物复苏和细线、表情皱纹等的校正此外，针管必须具有非常大的尺度；从而凝胶必须可以容易地挤压，并比前述凝胶具有更小的粘性因此，基于选择的 ACP HBC比率可以调节产品的流变学特性ACP(或HYADD)/HBC组分是等同的，生物材料的特性还可以通过靶向选择制备其的赋形剂适当地调节例如，将ACP HBC为50 50 (重量)的混合物分散在盐溶液(0.9% NaCl)中比如果将其分散在PH = 6. 95的磷酸盐缓冲液中更有粘性；因此，对于这种特定的混合物，为了制备在原位具有有限分散率的产品，盐溶液是更合适的介质主要由HBC组成的材料显示出相反的特性材料的粘弹性特性因此影响产品的性能本发明还涉及如上描述的两种生物材料的制备方法方法A和方法B新方法A和B分为两个步骤1.用于生成HBC衍生物的方法，和2.用于将其与ACP或HYADD衍生物混合的方法这两个步骤导致产生了具有非常高纯度的产物使用通常用于产生与BDDE交联的HA的方法，通过洗涤所获得的凝胶团块(mass)或者通过透析进行纯化在两种情况下， 由于掺入了大量溶剂的凝胶基质的性质(鉴于其膨胀倾向)，所以不能实现最佳纯化效率 这些凝胶具有低流动性和运输能力，倾向于沉淀为胶凝状胶状物如此获得的沉淀被分离为固体，当再水合时具有不同的溶解性和流变学特性，特别是膨胀度、弹性和均一性(填料的基本特征)然而，以下由本申请人描述为方法A的本方法以细碎粉末形式沉淀产物，因此容易洗涤此外，在沉淀和洗涤后，通过再水合和灭菌，精心选择的反应条件产生了具有凝胶重建能力的产物，产生的生物材料具有可重复的、良好标准化特征的弹性和均一性方法B不包括将HBC产物沉淀为粉末的步骤；(混合HBC与ACP或HYADD后获得的)凝胶的纯化和均一化在粉碎步骤实现，其包括使其通过具有25 μ m至150 μ m颗粒物质保留系数的滤器该步骤纯化最终的凝胶并使得其具有理想的均一性在本发明中用于制备上述衍生物(HBC、ACP和HYADD)的HA可以来源于任意来源，如提取自鸡冠花(cockscombs)或者发酵，具有400至3X10^1、优选地IX IO5Da至 1 X IO6Da且甚至更优选地200，000至1 X IO6Da的平均分子量新制备方法A包括以下步骤交联HBC的合成1.在二环氧化BDDE的碱性溶液(优选地0. 15M-0. 35M NaOH)中以2. 5%至25% (摩尔)，优选5%至15% (摩尔)(取决于产品的预期用途；BDDE的百分比越高，停留时间越长)的化学计量比溶解重复单位的透明质酸，然后2.在室温，在前项中所述的溶液中分散HAHA浓度必须在80mg/ml至300mg/ml， 均一化时间为30分钟至300分钟3.通过加热激活引发反应，在35°C至55°C的温度加热所述溶液2小时至36小时4.挤压所获得的团块通过金属筛，以将其降低成大约600 μ m大小的颗粒5.在4°C至的温度，通过用水以3至25倍稀释，水合凝胶4小时至48小时6.用浓度为0. 5至5摩尔/升、优选1至2摩尔/升的HCl水溶液校正pH至中性7.添加2. 5倍体积的水溶性有机溶剂，如乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、二巧I烷、乙腈、丙酮和/或它们的混合物(优选地乙醇和丙酮)，直到获得沉淀粉末形式的产物8.用含有水百分数在35%以下的有机溶剂洗涤，如乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、 二巧恶烷、乙腈、丙酮和/或它们的混合物(优选地乙醇和丙酮)9.在30°C至45°C的温度、在真空下干燥2至7天，并且在任何情况下直到将残余溶剂去除在400ppm以下，获得白色HBC粉末ACP (或 HYADD)与 HBC 的混合10.以10 90至90 10的ACP HBC比率(取决于所选择的用途，如前所述) 将HBC粉末与ACP (或HYADD)粉末混合11.在01至^rc的温度，用盐溶液或磷酸盐缓冲液、优选盐溶液(其可以含有另外的赋形剂如利多卡因)水合，产生12mg/ml至27mg/ml、优选20mg/ml至25mg/ml的总HA 浓度12.通过具有50 μ m至500 μ m、优选100 μ m至250 μ m筛孔的筛挤压所述过滤在室温或者在25°C至65°C、优选在40°C至60°C的温度进行13.用获得的产物填充优选由玻璃或者聚合物材料制备的注射器14.用饱和蒸汽在120°C至的温度(优选121. 5士 1°C )加热灭菌至少10分钟新制备方法B包括以下步骤交联HBC的合成1.在二环氧化BDDE的碱性溶液(优选0. 15M-0. 35M NaOH)中、以2. 5%至25% (摩尔)、优选5%至15% (摩尔)(取决于产品的预期用途)的化学计量比溶解重复单位的透明质酸，然后2.在室温，在前项中所述的溶液中分散HAHA浓度必须在80mg/ml至300mg/ml， 均一化时间为30分钟至300分钟3.通过加热激活引发反应，在35°C至55°C的温度加热所述溶液2小时至36小时4.用浓度0. 05摩尔/升至1摩尔/升、优选0. 1摩尔/升的HCl水溶液校正pH至中性5.在4°C至的温度，通过用水以3至20倍稀释，水合凝胶4小时至48小时 该溶液可以另外含有赋形剂，如NaCl、磷酸钠或者钾盐和利多卡因，优选地以盐酸盐形式 钠盐(氯化钠或者磷酸钠)具有维持产物的合适渗透压的功能，并将PH维持在与组织相兼容的值在本发明优选的实施方案中，加入的NaCl的量使得最终溶液含有0.8%至1.0% 的浓度，优选0. 9% ；如果存在盐酸利多卡因，那么其加入量使得最终制剂含有2. 2mg/ml至 3. 2mg/ml 的量，优选 2. 7mg/mlACP (或 HYADD)与 HBC 的混合6.取决于选择新填料的用途，如前所述，以10 90至90 10的ACP(或 HYADD) HBC比率(以活性成分的重量计)将HBC凝胶与ACP (或HYADD)粉末混合备选地，两种组分都以凝胶形成开始将ACP或HYADD与HBC混合，使用合适的搅拌系统(优选地用轨道刀片(orbital blade))，在0°C至的温度搅拌30分钟至M小时7.通过具有25 μ m至150 μ m、优选40 μ m至IlOym的颗粒物质保留系数的滤器， 粉碎并均一化如果粘度过高，该操作可以在25°C至65°C的温度加热进行8.用所获得的产物填充由玻璃或聚合物材料制备的注射器9.在120°C至的温度(优选121. 5士 1°C )用饱和蒸汽灭菌至少10分钟以下举例而非限制地描述了制备本发明新填料的一些实施例实施例1 HBC 500 (HA 50Q-730kDa)的合成方法A将通过发酵产生的0. 075摩尔分子量为500-730kDa的HA分散在含1. 41ml BDDE 的215ml 0. 25M NaOH溶液中然后将该混合物加热到42°C并反应3小时然后用300ml 含化学计算量HCl的溶液水合该混合物M小时，以调整pH至中性使总体积为750ml，用2. 5倍体积的乙醇沉淀，获得可滤过的、可滗析的沉淀物将混合物用75%乙醇洗涤，直到彻底纯化，通过测量洗涤溶剂的比电导率验证，其应当低于30μ S/cm，在40°C真空下干燥5 天获得HBC 500产物，重量产率87%实施例2 HBC 1000 (HA IMDa)的合成方法A将通过发酵产生的1. 60g平均分子量为IMDa的HA分散在含75 μ IBDDE的20ml 0.25M NaOH溶液中然后将该混合物加热到42°C并反应2小时然后用20ml含化学计算量HCl的溶液水合该混合物M小时，以调整pH至中性使总体积为75ml，用2. 5倍体积的乙醇沉淀HBC，以获得可滤过的、可滗析的沉淀物将混合物用75%乙醇洗涤，直到彻底纯化，通过测量洗涤溶剂的比电导率验证，其应当低于30 μ S/cm，在40°C真空下干燥5天获得产物HBC 1000，重量产率90%实施例3 HBC 200 (HA 200MDa)的合成方法A将通过发酵产生的2. 55g平均分子量为200KDa的HA分散在含63 μ IBDDE的20ml 0.25M NaOH溶液中然后将该混合物加热到42°C并反应150分钟然后用20ml含化学计算量HCl的溶液水合该混合物M小时使总体积为75ml，用2. 5倍体积的乙醇沉淀，以获得可滤过的、可滗析的沉淀物将混合物用75%乙醇洗涤，直到彻底纯化，通过测量洗涤溶剂的比电导率验证，其应当低于30 μ S/cm，在40°C真空下干燥5天获得产物HBC 200，重量产率85%实施例4 制备比率为50 50的ACP HBC 500凝胶方法A将1. OOg如实施例1中所述制备的HBC 500与1. OOg HA ACP内酯混合在8°C的温度用IOOml 0.9% (重量/体积)无菌盐溶液水合粉末16小时将所获得的凝胶加热至 48°C，通过具有0. 17mm筛孔的金属筛过滤，然后分布在Iml玻璃注射器中，其随后在121°C 的温度经历饱和蒸汽灭菌循环10分钟获得适合于局部施用的均一无菌凝胶实施例5制备比率为30 70的ACP HBC 1000凝胶方法A将1. 40g如实施例2所述制备的HBC 1000与0. 60g HAACP内酯混合在8°C的温度用IOOml 0.9% (w/v)无菌盐溶液水合粉末16小时将获得的凝胶加热至48°C，通过具有0. 17mm筛孔的金属筛过滤，然后分布在Iml玻璃注射器中，其随后在121°C的温度经历饱和蒸汽灭菌循环10分钟获得适合于局部施用的均一无菌凝胶实施例6制备比率为25 75的ACP HBC 500凝胶方法A将1. 875g如实施例1所述制备的HBC 500与0. 625g HA内酯ACP混合在8°C的温度用IOOml 0.9% (w/v)无菌盐溶液水合粉末16小时将获得的凝胶加热至48°C，通过具有0. 19mm筛孔的金属筛过滤，然后分布在Iml玻璃注射器中，其随后在121°C的温度经历饱和蒸汽灭菌循环12分钟获得适合于局部施用的均一无菌凝胶实施例7制备比率为75 25的ACP HBC 1000凝胶方法A将0. 50g如实施例2所述制备的HBC 1000与1. 5g HA内酯ACP混合在8°C的温度用IOOml 0.9% (w/v)无菌盐溶液水合粉末M小时将获得的凝胶加热至42°C，通过具有0. 17mm筛孔的金属筛过滤，然后分布于2ml玻璃注射器，其随后在121°C的温度经历饱和蒸汽灭菌循环12分钟获得适合于局部施用的均一无菌凝胶实施例8制备比率为60 40的HYADD HBC 500凝胶方法A将1. 20g如实施例1所述制备的HBC 500与0. 8g HA十六烷基酰胺(HYADD)混合在8°C的温度用IOOml 0.9% (w/v)无菌盐溶液水合粉末M小时将获得的凝胶加热至52°C，通过具有0. 17mm筛孔的金属筛过滤，然后分布于Iml玻璃注射器，其随后在121°C 的温度经历饱和蒸汽灭菌循环11分钟获得适合于局部施用的均一无菌凝胶实施例9制备比率为40 60的HYADD HBC 500凝胶方法A将通过发酵产生的平均分子量为500-7301(0￡1的8.(^ HA钠盐分散在含0. Mml BDDE的40ml 0. 25M NaOH溶液中然后将该混合物在41. 5°C加热2小时40分钟然后用 IOOml 0. IM HCl溶液和200ml水水合过夜加入50ml NaCl的饱和溶液，让混合物膨胀过夜第二天，加入170ml丙酮和30ml饱和NaCl溶液，缓慢加入1升乙醇沉淀混合物用相同的溶剂洗涤沉淀，直至消除NaCl残余，然后在35°C真空下烘箱干燥，直至残余溶剂已经消除将由此获得的HBC粉末以5 3的比率与如专利EP 1853279所述制备的HYADD混合将混合的粉末用盐溶液水合，得到总浓度20mg/ml (对应于12. 5mg/ml HBC和7. 5mg/ ml HYADD4)使产物在5°C膨胀过夜，次日通过具有100 μ m公标颗粒物质保留率的平板膜过滤将Iml玻璃注射器用如此获得的产物填充，并在121. 5°C在FO = 13的循环中灭菌实施例10HYADD HBC凝胶在真皮内兔施用模型中的皮肤填充和耐受性实验的目的是通过与市售填料BELOTERO 比较，评价注射到兔真皮内组织的HYADD HBC凝胶(如实施例9所述制备)引发的皮肤填充、任一肉眼可见的副作用的发病，以及组织响应对于所述评价，将测试的凝胶真皮内施用至体重为1. 8-2. 3kg的雄性NZW-KBL兔实验设计通过静脉内施用氯胺酮和赛拉嗪麻醉动物对于测试的每种填料，使用3只动物第0天巡-在剃去兔背上的毛后注射样品(每一样品Iml水凝胶)；-测量所有兔的膨胀并肉眼观察副作用第7 天！！-测量膨胀体积并肉眼观察副作用-用以下公式计算膨胀体积(2/3x3i)x(rl)x(r2)x(r3)其中(rl)、(r2)和(r3)分别表示用卡尺测量的膨胀的宽、长和高结果新填料在经处理的真皮中没有引起任何炎症事件获得的停留时间的结果显示于