专利名称：一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法酶作为生物催化剂在工业上有着悠久的应用历史。因酶在催化反应中具有选择性高、条件温和等优点，使酶在有机合成等领域有很高的应用价值。如利用酶催化反应合成手性化合物，符合绿色化学的发展方向，具有广阔的应用前景。目前已知的酶有5536种，其中氧化还原酶有1513种，占27. 3%(至2012年3月11日)。当氧化还原酶催化底物发生反应时需要电子供体或受体。生物体内众多的氧化还原酶在反应时，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (也称辅酶I，简写为NAD (H))或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(也称辅酶II，简写为NADP (H))以及黄素腺嘌呤二核苷酸或黄素单核苷酸等辅酶的参与。其中又以辅酶NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶所占比例最大。近年来，以氧化还原酶为基础的临床诊断、生物感应器、再生辅酶系统、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等技术都取得了令人瞩目的进展。氧化还原酶被用于不对称合成功能性类固醇、手性药物制剂、合成或修饰聚合物、氧化羟基及构建生物感应器等各个方面。其中NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶在手性合成中有着重要的作用。如脱氢酶催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的还原，使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医药、食品、精细化工等领域。同时在催化还原硝基化合物、啤酒生产过程、农业废弃物等方面中研究氧化还原酶活性，给实际生产生活也带来巨大效益。目前，筛选生物催化剂的手段主要包括从大量酶源中高通量筛选生物催化剂及宏基因组途径。对于氧化还原酶的筛选，已有报道([l]Gilles Ravot, DenisWahler,Olivier Favre-Bulle, et al. High Throughput Discovery of AlcoholDehydrogenases for Industrial Biocatalysis[J]. Advanced Synthesis andCatalysis, 2003，345(6-7) :691-694)利用宏基因组手段高通量挖掘乙醇脱氢酶。虽然分子克隆技术已足以完成宏基因组文库的构建及筛选，但是宏基因组在宿主细胞中不表达或表达量低、活性克隆子的频率极低等制约了它的实用性。相比较而言，从大量酶源中高通量筛选氧化还原酶是一条切实可行的发掘有实际应用价值的生物催化剂之路。在以往的生物催化剂高通量检测方法建立研究中，基本都是只着眼于某一种特定酶的高产菌株的高效筛选。而在每个细胞中往往含有上成千上万种酶，仅氧化还原酶就成百上千，这样导致在筛选过程中无法充分挖掘所考察菌株的实际应用价值，在人力、资源及时间成本上都造成了极大的浪费。因此发掘氧化还原酶宝库需要新的技术策略，迫切需要寻找一种简便、高效、经济的高通量技术与方法来筛选有重要工业应用价值的NAD(H)和NADP (H)依赖型氧化还原酶
本发明的目的在于提供一种效率较高、可增大发现有实际应用价值酶的概率，以克服现有的筛选手段实用性不高、资源浪费较大、效率较低等缺陷的筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，所述辅酶依赖型氧化还原酶包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，记为NAD (H))和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II，记为NADP (H))依赖型氧化还原酶。本发明包括以下步骤I)建立NAD⑶和NADP⑶依赖型氧化还原酶库；2)对步骤I)中所述氧化还原酶，依据其反应条件进行分类；3)对步骤2)中的每一类氧化还原酶通过实验统一其反应条件，建立对应的氧化还原酶系的检测平台；4)建立菌株库；5)利用检测平台对菌株库进行高通量酶活检测，筛选得NAD⑶和NADP⑶依赖型氧化还原酶。在步骤I)中，所述NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶库中的氧化还原酶可运用于临床诊断、生物感应器、再生辅酶系统、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等工业应用领域或可运用于代谢过程研究等生物科学研究领域。在步骤2)中，所述反应条件包括反应温度、反应缓冲液、激活因子等。在步骤3)中，所述反应条件包括反应温度、反应缓冲液、激活因子等，所述反应温度的统一可采用以下方法分别在不同测定温度下，考察多种酶的酶活情况，从而统一各酶的反应温度，所述不同测定温度的范围可为0 100°C ;所述反应缓冲液的统一可采用以下方法考察各种缓冲液对多种酶检测的影响，从而统一各酶的反应缓冲液，所述缓冲液的pH范围为I 12，缓冲液的种类包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等；所述激活因子的统一可采用以下方法通过考察各种金属离子在不同浓度下对各种酶检测的影响，从而统一各酶的激活因子，所述金属离子可为钙、锰、锌、镁、钾、钠、铁、铝、锶、钡、铜、铅、锡、钴、镍等；所述建立对应的氧化还原酶系的检测平台的方法可为配制每个氧化还原酶系检测平台的反应母液，反应母液包含经统一后反应所需的缓冲液和激活因子。在步骤4)中，所述菌株库中的菌株为分离自重金属污染的菌株，难降解有机物污染等特殊生态环境的菌株，分离自深海、冰川、火山口等极端环境的菌株，具高活力氧化还原酶潜力的菌株等。在步骤5)中，所述高通量酶活检测的具体方法如下(I)向微孔板中加入反应母液，所述微孔板包括12、48、96、384孔等；(2)分别向各微孔加入所测定各酶系的特异性底物；(3)加入检测样品启动反应；(4)使用酶标仪在340nm下利用初速度法检测样品中一类氧化还原酶的酶活力，酶活定义为在规定条件下，每分钟催化生成或者消耗Iumol NAD (P) H所耗酶量为I个酶活力单位。初速度法中所涉及酶活的计算公式为酶活力单位(U/mL) = (VT X A A X K) / ( e X Vs X L)其中Vt :反应液总体积；VS :样品体积；AA :每分钟吸光度变化值；K :样品稀释倍数;e :摩尔吸光系数(e =6. 22L/mmol/cm) ；L :光程。由于NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶的酶活检测皆可基于同种酶活检测原理，即通过观察由NAD (P)H的生成或消耗而导致的340nm处吸光度的变化来监测酶动力学，因此NAD (H)和NADP (H)依赖型氧化还原酶这一类酶的检测皆可通过初速度法实现，这样就消除了不同酶之间检测方式、仪器要求以及结果处理的差异性。在此基础上，通过统一多种酶的反应条件(温度、缓冲液及激活因子)，建立多酶体系高通量检测平台。运用所建立平台可对大量菌株同时进行多种氧化还原酶酶系的检测，从而筛选得生产高活力氧化还原酶菌株。与现有技术相比，本发明的积极效果在于I)本发明可高通量检测NAD⑶和NADP⑶依赖型氧化还原酶。2)根据反应条件的差异，将所考察NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶进行分类，并就其中每一类建立对应的高通量检测平台，该平台可运用于以获得具工业应用价值氧化还原酶为目的的筛选工作，也可运用于以研究生物体内动态代谢过程为目的的科学研究工作。 3)采用微孔板(12、48、96、384孔等)高通量检测NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶的酶活，在传统NAD (H)和NADP (H)依赖型氧化还原酶的酶活检测基础上，利用平台可以简便快速地对大量菌株同时进行多种酶的酶活检测，有利于最大限度地同时挖掘所考察菌株的应用潜力。4)在代谢研究中，该高通量检测平台能有效简化代谢关键氧化还原酶检测时的操作，提高检测效率，减少人力、物力及时间成本的投入。一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，涉及一种氧化还原酶。提供一种效率较高、可增大发现有实际应用价值酶的概率，以克服现有的筛选手段实用性不高、资源浪费较大、效率较低等缺陷的筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，所述辅酶依赖型氧化还原酶包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依赖型氧化还原酶。建立NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶库；对所述氧化还原酶，依据其反应条件进行分类；对每一类氧化还原酶通过实验统一其反应条件，建立对应的氧化还原酶系的检测平台；建立菌株库；利用检测平台对菌株库进行高通量酶活检测，筛选得NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶。