专利名称：预防或治疗癌症及与癌症相关的骨损失的组合物和方法许多癌症可以在远离肿瘤生长初始位置的组织和器官内建立。这种肿瘤，叫做转移性肿瘤，可引起广泛的并发症，而这些并发症经常是致死性的。骨骼是实体肿瘤扩散的一个好发部位，仅次于肝和肺。肿瘤细胞侵袭的结果是破骨细胞，促进骨吸收的骨内的主要吸收，被过度活化并开始加速破坏骨骼。破骨细胞被诸如甲状旁腺激素相关的肽(PTHrP)和白细胞介素-1(IL-1)等物质激活，这些物质在骨的微环境中增加，也可由肿瘤细胞产生。作为破骨细胞活性增加的结果，患有骨癌的病人常发展为溶解性的骨损伤。这种情况叫做溶骨性骨转移。骨溶解可导致病理性骨折、脊萎缩、高钙血症以及骨痛，是引发死亡率和发病率的一个主要原因。另外一种情况是，如在前列腺癌骨转移中，破骨细胞性骨损伤的增加伴随有骨形成的增加，但这种增加没有组织性(Kylmaelae等，Brit.J.Cancer 71，1061-1064(1995))。原来的骨被去除了，被替代成网状无结构的骨，以至于骨结构上的整合性损失。这也可导致骨痛和其它发病。除此之外，破骨细胞活化可增加肿瘤细胞转移到骨然后在该环境下生长的习性。已证实破骨细胞释放细胞因子，如IL-6，它是一些血液肿瘤细胞，如多发性骨髓瘤细胞，的生长因子(O″Keefe等，Lab.Invest.76，457-465(1997))。此外，证实在骨吸收的过程中破骨细胞从骨基质中释放出生长因子。它们包括成纤维细胞生长因子和转化生长因子β，已知它们促进许多实体瘤的生长。破骨细胞的活性就能以这种方式在骨内给转移性播种创造一个生育环境，并且随着肿瘤细胞开始生长以及促进骨吸收，破骨细胞的活性能引起生长因子从骨内释放以维持肿瘤扩展。目前可获得的肿瘤治疗剂可以减少或抑制肿瘤生长，但对进行性溶解性骨病的效果很小。据报道，一些化疗方案实际上归功于与血液系统恶性肿瘤相关的骨损失，如多发性骨髓瘤和何杰金氏疾病以及促性腺激素释放的激素受体激动剂情况下的骨损失。一但肿瘤扩散到骨，就很难用目前的方案进行治疗。因此期望能早期预防骨转移的发生并治疗骨转移以预防骨损失。骨抗吸收剂抑制破骨细胞的数目和/或活性，并减低骨破坏的速率。这些试剂也许可用于预防和/或治疗与骨癌相关的骨吸收。据报道双磷酸盐(bisphosphonates)，如risedronate、ibandronate和pamidronate，它们是抗吸收的化合物，可以在小鼠肿瘤模型中以及患有乳腺癌和多发性骨髓瘤和其它肿瘤的骨转移的病人中降低骨事件(如病理性骨折、脊萎缩、骨手术或放疗)的严重性。此外有报道说双磷酸盐可降低前列腺癌骨转移的骨痛和其它骨骼事件。但是，双磷酸盐的效果有限，即使输入高剂量的双磷酸盐才在骨事件中产生少量的降低。当口服时，双磷酸盐的效果降低，并能引起胃肠道刺激(如胃灼热、消化不良和恶心)，如果施用不当某些情况下可引起食道溃疡。Osteoprotegerin(OPG)在PCT WO97/23614中有过描述，并发现它体外和体内负向调节破骨细胞的形成。在表达OPG多肽的转基因小鼠中，OPG可提高骨密度，当它用到卵巢切除的大鼠中时可减低骨损失的程度。OPG在体外破骨细胞形成中的活性分析表明OPG阻断破骨细胞从单核/巨噬细胞前体的分化。OPG似乎在调节破骨细胞形成的程度中有特异性。OPG是阻断骨吸收的有效因子，并且可用于预防或治疗骨质的损失。同样观察到，包括OPG和一Fc功能区的融合蛋白体内外均具有抑制破骨细胞形成和阻断骨损失的活性。因此本发明的一个目标就是提供治疗癌症相关骨损失的其它方法和组合物，它能克服目前治疗中存在的许多问题。本发明的再一个目标是提供其它预防癌症相关骨损失的方法和组合物，它是通过预防性治疗来降低骨转移的发生和/或延迟骨转移的发病。本发明的再一个目标是提供预防和/或治疗多发性骨髓瘤的其它方法和组合物。
发明概述本发明提供一种治疗或预防哺乳动物溶解性骨疾病的方法，它包括施用治疗有效量的OPG多肽。溶解性骨病在患有转移性骨肿瘤的哺乳动物中经常看到。这种肿瘤的实例包括有乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，肾脏肿瘤，肺、食管、直肠、膀胱和官颈癌，以及胃肠道的肿瘤。也包括某些血液系统的恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤，如何杰金氏疾病。还包括转移性骨病，该疾病增加骨吸收和骨形成，从而导致与骨病相关的骨硬化性骨转移或溶解性的和骨硬化性的混合性转移，以及骨结构整合性的损失，如同在前列腺癌中那样。
本发明还提供一种预防肿瘤转移到骨骼的方法，它包括施用治疗有效量的OPG多肽。
本发明还提供一种预防或治疗哺乳动物转移性骨疾病的方法，它包括施用治疗有效量的OPG多肽，与肿瘤治疗剂联合应用。肿瘤治疗剂可以是常用的治疗肿瘤生长的任何一种，包括放疗和化疗剂。这些药剂的例子包括蒽环类，紫杉酚，三苯氧胺，抗体，如抗Her2抗体或抗CD20抗体，受体激动剂和拮抗剂，如黄体化激素释放激素(LHRH)拮抗剂。OPG多肽组合物可先于肿瘤治疗剂施用，或一起施用，或随后应用。
本发明还提供一种治疗多发性骨髓瘤的方法，它包括施用治疗有效量的OPG多肽。
本发明的多肽包括那些具有抑制骨吸收活性并可用于预防和/或治疗骨质损失或预防骨硬化性骨转移(无组织的结构缺陷骨替代了结构完好的骨)的多肽。优选的实施方案是，OPG多肽是包括OPG和一异源肽或蛋白质的融合蛋白。这种融合蛋白具有较长的循环半衰期和较短的清除时间，因此可提供更稳定的抗吸收活性及较低的施用频率。在一个方面，该异源蛋白是一免疫球蛋白Fc区，或其变异片段，或其衍生物。
附图简述

图1显示了人IgGγ1 CH2区、CH3区和铰链区的氨基酸序列。
图2为OPG[1-401]的氨基酸序列。
图3给出了OPG[22-194]-Fc的氨基酸序列。
图4给出了OPG[22-201]-Fc的氨基酸序列。
图5给出了OPG[22-194]-FcΔC的氨基酸序列。
图6给出了OPG[22-201]-FcΔC的氨基酸序列。
图7给出了OPG[22-194]-FcG10的氨基酸序列。
图8给出了FcΔC-OPG[22-194]的氨基酸序列。
图9显示了在肿瘤转移至骨的C26-DCT和MDA-MB-231模型中骨溶性骨破坏的预防。直接注射到小鼠的左心室后两种细胞类型均造成局部的骨破坏(黄箭头)。左边的图表明施用C26-DCT细胞10天后X光线照片上的损伤明显，施用MDA-MB-231细胞28天后明显。右边的图显示用metFcΔC-OPG[22-194]治疗(25mg/kg)，C26-DCT小鼠每3天一次，治疗10天，MDA-MB-231小鼠每周3次共4周，对损伤形成的预防。
图10显示了注射了C26-DCT细胞的小鼠射线照相中骨溶灶数目的减少对metFcΔC-OPG[22-194]的剂量依赖性。
图11A和11B显示了在小鼠C26-DCT肿瘤模型中与恶性肿瘤相关的高钙血症的预防和逆转。在预防性研究中，met FcΔC-OPG[22-194]每天皮下注射。在逆转研究中，met FcΔC-OPG[22-194]通过单次静脉内注射施用。报告的是平均血钙值±SEM。
发明详述本发明提供预防和治疗肿瘤相关骨损失的组合物和方法。本发明也提供应用抗骨吸收的制剂来预防和治疗肿瘤的方法。本发明优选的组合物和方法包括OPG和OPG融合多肽。更具体而言，本发明涉及应用OPG融合蛋白组合物来预防和/或治疗肿瘤，或者预防和/或治疗肿瘤相关的骨损失。
出乎意料的是，我们发现Fc区与截短了的OPG多肽融合优于未融合的截短了的OPG多肽或全长的成熟OPG(如图2所示(SEQ IDNO2)，全长成熟OPG有380个氨基酸，从22-401)。还发现Fc区在OPG多肽的羧基端融合时，与在OPG多肽氨基端发生融合时相比，显示出意料之外的优势。因此，下面对OPG多肽、其变异体、片段和其衍生物，以及相关的应用和制备方法进行更详细地描述。
“OPG”或“OPG多肽”指包括图2(SEQ ID NO2)中氨基酸序列的多肽及这里描述的相关多肽。相关多肽包括等位基因变异体，剪接变异体，片段，衍生物，替代、缺失和插入的变异体，融合多肽和非人类同源体。如这里定义的，OPG多肽可以是成熟多肽，它可以有或可以没有氨基末端的甲硫氨酸残基，这依赖于其制备方法。
“OPG融合蛋白”是指与一异源肽或蛋白连接的OPG蛋白或OPG多肽。本发明的OPG融合蛋白可以用该领域内任何适宜的方法进行制备，如通过遗传的或化学方式将OPG和异源肽或多肽的部分融合。本发明的一个实施方案中，异源肽或多肽是免疫球蛋白的Fc区，优选人类的免疫球蛋白。
“成熟的OPG多肽”或“成熟的OPG融合多肽”是指缺乏引导序列并也可包括其它修饰的多肽或融合多肽，其它修饰有，如氨基端(有或无引导序列)和/或羧基端的蛋白水解过程，从一大的前体上切下一小的多肽，N-连接和/或O-连接的糖基化等。
“Fc”指包括抗体的非抗原结合部分序列的分子或序列，无论是单体形式还是聚合物形式。Fc的起始来源优选人源，可以来自任何一同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。制备独立的Fc分子的一种方法包括用木瓜蛋白酶消化抗体，将抗体分成抗原结合部分和非抗原结合部分。制备独立的Fc分子的另一种方法是由重组DNA表达产生，然后对表达的Fc分子进行纯化。一个全长的Fc包括下列Ig重链区CH1、CH2和CH3，其中CH1和CH2区由一个可弯曲的铰链区连接。在一实施方案中，Fc具有如图1所示的IgG1的氨基酸序列。“Fc蛋白”、“Fc序列”、“Fc分子”、“Fc区”和“Fc部分”与“Fc”意义相同。
当“片段”与Fc或OPG多肽，或其融合蛋白关联应用时，它指包括小于Fc或OPG多肽全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可来自，例如，氨基端的截短，羧基端的截短，和/或氨基酸序列残基的内部缺失。OPG或Fc片段还可从RNA剪切或从体内蛋白活性得到。
当“变异体”与Fc或OPG多肽，或与其融合多肽用在一起时，它指的是一种多肽，该多肽包括的氨基酸序列与原本Fc或OPG多肽氨基酸序列比较时，包含有一个或多个氨基酸序列的替代、缺失和/或添加。变异体可以是自然产生的或是人工构建的。本发明的变异体可由编码该变异体的相应核酸分子制备，该核酸分子具有的DNA序列与原本Fc或OPG多肽的DNA序列不同。
当“衍生物”与Fc或OPG多肽，或与其融合蛋白一起应用时，它是指Fc或OPG多肽的变异体或其片段，它们被化学修饰过，例如，一个或多个聚合物的共价粘附，聚合物包括并限于水溶性聚合物，N-连接或O-连接的糖链，糖，磷酸盐和/或其它类似分子。这些衍生物以不同于天然Fc或OPG的方式被修饰，属于粘附到多肽的分子的类型或位于该分子中。衍生物还包括一个或多个天然粘附到Fc或OPG多肽的化学基团的缺失。
“融合”是指不同的肽或蛋白段的连接，其中肽或蛋白段的连接末端可以直接彼此毗邻，或被连接体(linker)或间隔子(spacer)部分，如氨基酸残基分离，或被其它连接基团分离。融合可通过遗传学或化学手段，应用该领域的技术人员熟知的程序来完成，但连接手段并不限于这里提到的这些。多肽本发明提供OPG融合多肽及其组合物，更具体而言，提供包括OPG和Fc部分的融合多肽。Fc区与OPG多肽的融合可在OPG的氨基端进行，即Fc区的羧基端融合到OPG的氨基端。这里把这些融合蛋白(和编码它们的核酸)标记为FcOPG。OPG羧基端融合到Fc区的氨基端也是可行的。这里我们把这样的融合蛋白(和编码它们的核酸)记作OPGFc。
Fc或其变异体、片段或衍生物，可来自免疫球蛋白(Ig)类。一实施方案中，Fc来自IgG，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一实施方案中，Fc来自IgG1。Fc还可包括任何两种或多种Ig类合并所代表的氨基酸残基，如IgG1和IgG2残基或来自IgG1、IgG2和IgG3等的残基。在一实施方案中，OPG融合蛋白的Fc区具有下图1中的序列(SEQID NO)，包括人类IgG1CH2和CH3区的铰链区(参见Ellison等，Nucleic Acids Res，10，4071-4079(1982))。
Fc区、Fc变异体、片段和衍生物中除有自然发生的变异外，也包含Fc内非自然发生的变化，这种变化通过，例如，在天然或自然产生的Fc中导入替代、添加、插入或缺失的残基或序列，或通过化学修饰等手段修饰Fc部分。总体上讲，Fc变异体、片段和衍生物的制备原则是融合到OPG的Fc循环半衰期的增加能大大维持。
本发明还提供的是具有保守氨基酸替换的Fc和OPG变异体。“保守的氨基酸替代”是指这样一种替代非天然氨基酸替代天然氨基酸残基，而对该位置氨基酸残基的极性或电荷的影响甚小或无。例如，用任何其它非极性残基替代多肽中非极性残基而产生的保守替换。保守氨基酸替换的普通原则列于表1。
表1保守的氨基酸替换原来的残基 替换举例优选替换丙氨酸 缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸缬氨酸精氨酸 赖氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺 赖氨酸天冬酰胺谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸谷氨酰胺天冬氨酸谷氨酸 谷氨酸半胱氨酸丝氨酸 丝氨酸谷氨酰胺天冬酰胺天冬酰胺谷氨酸 精氨酸 精氨酸甘氨酸 脯氨酸，丙氨酸 丙氨酸组氨酸 天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸 精氨酸异亮氨酸亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、 亮氨酸苯丙氨酸，正亮氨酸亮氨酸 正亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、 异亮氨酸丙氨酸、苯丙氨酸赖氨酸 精氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺 精氨酸甲硫氨酸亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸 亮氨酸苯丙氨酸亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、 亮氨酸酪氨酸脯氨酸 丙氨酸 丙氨酸丝氨酸 苏氨酸 苏氨酸苏氨酸 丝氨酸 丝氨酸色氨酸 酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸 色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸苯丙氨酸缬氨酸 异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、 亮氨酸丙氨酸、正亮氨酸保守性氨基酸也包含非自然发生的氨基酸残基，它们典型地通过化学肽合成而整合入的，而非生物合成的。这些包括肽的模拟物，和其它反相或颠倒形式的氨基酸部位。氨基酸序列的保守性修饰(以及编码核酸的相应修饰)是希望使Fc和OPG分子(以及OPG融合蛋白)与那些未经修饰的Fc、OPG和OPG融合蛋白具有功能上和化学上的相似性。
除表1中列出的替代外，在Fc区或OPG多肽(或在FcOPG融合蛋白)中的任何天然残基均可被丙氨酸替代，如以前描述的“Alaninescanning mutagenesis”(Cunningham等，Science 244，1081-1085(1989))。
对Fc或OPG多肽(和OPG融合蛋白质)功能上和/或化学特性上的替代修饰可通过选择性替换来完成，这种替换根据其发挥的效果而有显著地差异，其效果为维持(a)替换区分子骨架的结构，例如，片层或螺旋构象；(b)目标位置分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链的大小。根据其共同的侧链特征，天然产生的残基可分为几组1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；2)中度嗜水半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；3)酸性精氨酸、谷氨酸；4)碱性天冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；5)影响链定向的残基甘氨酸、脯氨酸；6)芳香的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替换包括这些类中的一些成员换成其它类中的一些成员。这样替换的残基有可能被导入Fc或OPG分子与非人类Fc或OPG同源区域，或导入该分子的非同源区。
Fc分子中的半胱氨酸可被去除掉或被其它氨基酸替代以预防二硫键交联的形成。特别是图1(SEQ ID NO1)位点5的半胱氨酸残基可被一个或多个氨基酸，如丙氨酸或丝氨酸所替代。另外，该位置的半胱氨酸可被去除掉。
Fc片段的制备可通过去除掉图1(SEQ ID NO1)中所示1，2，3，4，5位点上的任何一个或多个氨基酸进行。在一Fc分子-FcΔC中，包括在位点1-5的氨基酸残基被去除掉。也可在这些位点进行替换并且替换要在本发明的范围内。
也有可能制备的Fc变异体与Fc受体结合的能力下降，而这种结合作用可启动效应功能，如抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)和补体的活化。这样的变异体包括位点20的亮氨酸被去除，或被谷氨酰胺残基替代；位点103的谷氨酸被去除或被丙氨酸残基替代；位点105和107的赖氨酸被去除或被丙氨酸残基替代(按图1中所示的编号)。期待有一个或多个这样的替代。
在一实施方案中，与天然Fc相比，Fc变异体展现与FcRn受体(“补救受体”)较强的结合及较长的循环半衰期。这样变异体的例子包括图1(SEQ ID NO1)中33，35-42，59，72，75，77，95-98，101，172-174，215，220-223一个或多个氨基酸残基的替换，其中替换使Fc变异体与FcRn受体的结合更牢固。
其它Fc变异体包括一个或多个酪氨酸残基被诸如苯丙氨酸残基所替代。此外，也期待其它不同氨基酸的插入、缺失和/或替代，它们也在本发明的范畴之内。实例包括这里引用的在WO96/32478和WO97/34630中公开的Fc变异体。此外，改变也许以改变的氨基酸形式，如肽模拟物或D-氨基酸存在。
Fc蛋白也可借助间隔或连接片段连到OPG融合多肽的OPG部分。这些间隔子或连接体是蛋白样的，即它们包括一或多个氨基酸，或者它们是化学连接体。这样的化学连接体在该领域内是众所周知的。氨基酸连接体的序列包括但并不限于以下这些(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(l)gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化学部分，和(n)(a)-(m)任何亚部分的组合。
OPG变异体、片段和衍生物也由本发明提供，如以上描述的Fc分子那样，希望氨基酸残基的修饰发生在特异的位点。OPG变异体、片段和衍生物在PCT WO97/23614中有所描述，在此引入作为参考。
在优选实施方案中，OPG融合蛋白的OPG部分是OPG截短状态的羧基端。OPG截短形式的羧基端有一个或多个在图2所示的186-401位点的氨基酸被去除掉。例如，OPG截短体包括氨基酸序列22-X，其中X是185-400的任一个残基。在另一实施方案中，OPG截短体包括氨基酸序列22-X，其中X是185-278，或185-293，或194-278，或194-293的任一残基。包括这里描述的OPG截短形式的多肽的融合蛋白包括OPG与异源肽或多肽的直接连接，或通过间隔分子或连接分子连接，其中间隔分子或连接分子适当包括一个或多个氨基酸残基。这里描述的OPG截短体的变异体和衍生物也包括在本发明内。
本发明中优选的融合蛋白包括那些其中OPG部分包括氨基酸序列22-X的蛋白，其中的X是图2(SEQ ID NO2)中所编码194-201中的任何一个残基。这样的融合蛋白的实例包括以下这些OPG[22-194]-Fc (图3和SEQ ID NO3)OPG[22-201]-Fc (图4和SEQ ID NO4)OPG[22-194]-FcΔC(图5和SEQ ID NO5)OPG[22-201]-FcΔC(图6和SEQ ID NO6)OPG[22-194]-FcG10(图7和SEQ ID NO7)FcΔC-OPG[22-194](图8和SEQ ID NO8)对于优选的多肽来说，“Fc”是指图1中所示人IgG1的序列；“FcΔC”是指图1(SEQ ID NO1)中所示缺少氨基酸残基1-5的序列；“FcG10”指缺少氨基酸残基1-9，具有Ser-(gly)连接体的Fc部分。核酸分子编码本发明的OPG融合蛋白或其衍生物、片段或变异体的核酸分子也由本发明所提供。本发明的核酸分子可通过该领域的技术人员已知的重组DNA方法学制备。例如参照Sambrook等(分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))，和Ausubel等(现代分子生物学方法，Wiley and Sons，N.Y.(1994))论述的论变技术。也可应用由Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.28，716-734(1989))论述的化学合成方法来制备这些变异体。也可应用其它的技术人员熟知的制备核酸分子的方法。
在某些实施方案中，核酸分子编码具有上面曾定义的保守氨基酸替代的OPG融合蛋白变异体。例如，保守氨基酸替换发生在融合蛋白的OPG和/或Fc部分。还提供这样的Fc或OPG变异体，它们包括一或多个N-连接或O-连接糖基化位点的缺失和/或添加，或包括上述的Fc或OPG多肽片段。本发明的核酸分子编码Fc和/或OPG变异体、片段的任一种组合以及这里描述的融合蛋白。
在另一实施方案中，核酸分子包含为了OPG融合多肽在给定的宿主细胞内最适表达而被改变了的密码子。特异的密码子改变将取决于OPG融合蛋白和选择的用于表达的宿主细胞。“密码子最适化”可通过各种不同的方法达到，例如通过选择在给定的宿主细胞中高表达基因中优选应用的密码子。也可应用整合了密码子机率表，如“Ecohigh.Cod”进行高表达细菌基因密码子优先选择的计算机运算法则，它由威斯康星大学的软件包Version 9.0，遗传学计算机组，Madison，WI提供。其它有用的密码子机率表包括“Celegans_high.cod”，“Celegans_low.cod”，“Drosophila_high.cod”，“Human_high.cod”，“Maize_high.cod”，和“Yeast_high.cod”。载体和宿主细胞应用标准的连接技术将编码OPG融合多肽的核酸分子插入到合适的表达载体中。在应用的特异宿主细胞内有功能的宿主被代表性地选择(即载体与宿主细胞的机制相匹配，这样可进行基因的扩增和/或表达)。编码OPG蛋白的核酸分子可以在原核细胞、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞内扩增/表达。宿主细胞的选择部分取决于OPG蛋白是否被翻译后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。如果这样，则优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。
典型地，在任何宿主细胞中应用的表达载体将包含质粒保持和外源核苷酸序列克隆和表达的序列。这些序列，在某些实施方案中统称为“侧翼序列”，代表性地包括一个或多个下列核苷酸一个启动子，一或多个增强子序列，一扩增的起点，一转录终止序列，包括一供体和受体剪切位点的完整内含子，分泌的引导序列，核糖体结合位点，多聚腺苷酸化序列，插入编码多肽的核苷酸使之表达的多聚连接体区，和选择性标志元件。
侧翼序列可以是同源(即与宿主细胞来自相同种和/或系)、异源的(即来自与宿主细胞不同的种或系)、杂交的(即多个来源的侧翼序列的组合)或合成的，或通常调节OPG和/或Fc蛋白表达的天然序列。由此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核有机体，任何脊椎或无脊椎有机体，或任何植物，只要该侧翼序列在宿主细胞内发挥功能，并且能被宿主细胞的机构激活。
先导序列或信号序列用于指导OPG融合蛋白出宿主细胞。信号序列最常见的位置是直接位于OPG融合多肽编码区的5′端。已鉴定出许多信号序列，其中在所选宿主细胞中发挥作用的任何一种均可与编码OPG融合蛋白的核酸序列连接应用。例如，信号序列可与OPG或Fc基因或cDNA同源(自然发生的)或异源。另外，信号序列也可用上述的方法进行化学合成。大多数情况中，OPG多肽通过信号肽的存在而从宿主细胞分泌出来往往会导致信号肽与融合蛋白脱离。
信号序列可以是载体的一部分，或是插入到载体中的OPG DNA的一部分。例如，OPG DNA在蛋白的氨基端编码一信号序列，它在分子的翻译后加工过程中裂开以形成成热的蛋白质(见图2)。具有原本的信号序列的OPG核苷酸以及原本的信号序列被去除并被异源信号序列替代的OPG核苷酸包括在本发明的范围之内。所选的异源信号序列应当是被宿主细胞识别和处理，即被信号肽酶裂解的。在一实施方案中，异源信号序列是WO97/23614中描述的OPG信号序列。由于原核的宿主细胞不能识别和处理原本的OPG与信号序列，所以该信号序列被一原核的信号序列替代，例如被选自碱性磷酸酶、青霉素酶、或热稳定性肠毒素II引导序列的信号序列替代。对于酵母分泌来说，原本的OPG信号序列被酵母逆转录酶、α因子或酸性磷酸酶的信号序列替代。在哺乳动物细胞中表达，原本的OPG信号序列是可以满足的，尽管其它的哺乳类信号序列也可适用。
实施本发明的优选的载体是那些与细菌、昆虫和哺乳类宿主细胞相匹配的载体。这些载体包括inter alia，pCRII，pCR3，pcDNA3.1(Invitrogen Co.，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene Co.，La Jolla，CA)，pET15b(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBac II；Invitrogen)，pDSRα2(PCT WO 90/14363)和pFast Bac Dual(Gibco/BRL，Grand Island，NY)。
其它可能的载体包括但并不限于柯斯质粒，质粒或修饰的病毒，但载体系统必须与选择的宿主细胞相匹配。这样的载体包括但不限于质粒，如Bluescript?质粒衍生物(高拷贝数ColE1为基础的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems Inc.，La Jolla CA)，为克隆Taq-amplifiedPCR产物而设计的PCR克隆质粒(如TOPOTM TA Cloning?Kit，PCR2.1?质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)和哺乳动物、酵母或病毒载体，如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，PaloAlto，CA)。重组分子可通过转化、转染、感染、电穿孔或其它已知的技术被导入宿主细胞。载体构建和编码OPG融合多肽的核酸分子被插入到载体的正确位置后，可将完整的载体插入到适宜的宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。
宿主细胞可以是原核的宿主细胞(如E.coli)或是真核的(如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。当在适当条件下培养时，宿主细胞合成OPG多肽，随后可从培养基(如果宿主细胞将它分泌到培养基中)中收集多肽，或直接从制备它的宿主细胞中收集(如果不被分泌)。合适宿主细胞的选择依赖于多种因素，如希望表达的水平，期望或活性必需的多肽修饰，如糖基化或磷酸化，以及折叠成生物学活性分子。
适宜的宿主细胞或细胞系可以是哺乳类细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC#CCL61和Urlaub等，PNAS USA 77，4216-4220(1980))，人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC#CRL1573)或3T3细胞(ATCC#CRL1658)。适宜哺乳类宿主细胞的选择和转化、培养、扩增、筛选及产物制备和纯化的方法是本领域由已知的。其它适宜的哺乳类细胞系为猴的COS-1和COS-7细胞系(ATCC#CRL1651)，以及CV-1细胞系(ATCC#CCL70)。其它的哺乳类细胞系的例证包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，其中包括转化的细胞系。源自原代组织及原代移植物体外培养的细胞株、正常二倍体细胞也适用。候选细胞在选择基因上存在基因型上的缺陷，或包含起决定作用的选择基因。其它适宜的哺乳类细胞系包括但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞，HeLa，小鼠L-929细胞，来自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3系，BHK或HaK仓鼠细胞系。其中的每一个细胞系都是本领域内的技术人员已知并可获得的。
适于本发明的同样可用作宿主细胞的为细菌细胞。例如，E.coli的不同菌株(例如HB101，DH5α，DH10，和MC1061)在生物技术领域是众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌，假单胞菌类，其它芽孢杆菌类，链球菌类的各种菌株也可同样用于该方法。
该领域的技术人员已知的酵母细胞的许多细胞株也可用作本发明的多肽表达的宿主细胞。优选的酵母细胞包括，例如酿酒酵母。
此外，我们期望昆虫细胞系统也可用于本发明的方法中。例如被Kitts等(Biotechniques，14，810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4，564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.，67，4566-4579(1993))描述过的系统。优选的昆虫细胞为Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
将OPG多肽的表达载体转化或转染所选宿主细胞可通过众所周知的方法完成，这些方法包括如氯化钙法，电穿孔法，显微注射，脂质体转染或DEAE-dextran方法。所选方法应某种程度上是所用宿主细胞类型的一种功能。这些方法及其它适宜的方法是本领域的技术人员所热知的，并列于前面，例如在Sambrook等中，同上。多肽制备应用技术人员已知的标准培养基培养通过转化或转染而包括编码OPG融合多肽的表达载体的宿主细胞。通常培养基中包含所有该细胞生存和生长所必需的营养物质。适于培养大肠杆菌的培养基为，如LuriaBroth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。培养真核细胞的适宜培养基为RPMI 1640、MEM、DMEM，根据培养的特殊细胞的要求可在所有类型的培养基中补添血清和/或生长因子。适于昆虫培养的培养基是Grace′s培养基，必需时可补充yeastolate，卵白蛋白水解产物和/或胎牛血清(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD)。
经典地，用于转染或转化细胞选择性生长的抗生素或其它化合物补加到培养基中。所用的化合物是由存在于转化宿主细胞的质粒中的选择性标志元件支配的。例如，当选择性标志元件为卡那霉素抗性时，加入到培养基中的化合物就为卡那霉素；而当选择性标志元件为氨苄青霉素抗性时，加入到培养基中的化合物就为氨苄青霉素。
宿主细胞产生的OPG融合多肽的量可用本领域内的标准方法估价。这些方法包括Western bolt分析，SDS-PAGE，非变性凝胶电泳，HPLC分离，免疫沉淀和/或活性栓测方法，如DNA结合凝胶转移方法。
当OPG融合多肽没有加标签，并且未得到抗体时，可用其它已知的程序进行纯化。这些程序包括，没有限制，离子交换色谱，分子筛色谱，HPLC，原本的凝胶电泳与凝胶洗脱结合，制备型等电聚焦(“isoprime”机器/技术，Hoefer Scientific)。在一些情况下，可两种或多种技术联用以增加纯度。
如果OPG融合多肽在胞内产生，可应用技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞提取出胞内物质(包括革兰氏阴性菌的包含体)。例如可通过French压力，匀浆，和/或超声后离心来裂解宿主细胞，使之释放周质/细胞质的内含物。
如果OPG融合蛋白在胞液中形成包含体，包含体常结合到胞膜的内面和/或外面，于是离心后主要在团块物质中发现包含体。然后用强pH或用离液剂处理团块，这些试剂有，如去污剂、胍、胍的衍生物、尿素或尿素衍生物，在还原剂如二硫苏糖醇在碱性pH条件或Tris羧乙基膦酸性pH，存在时处理，以释放、打碎、并使包含体可溶。溶解状态的OPG融合多肽可用凝胶电泳、免疫沉淀等进行分析。如果想分离OPG多肽，分离可应用下面给出的方法和Marston等(Meth.Enz.，182，264-275(1990))的标准方法完成。
某些情况下，经过分离OPG融合蛋白会没有生物学活性。可应用各种“重折叠”的方法或逆转多肽的三级结构和产生二硫键连接的方法来修复生物学活性。这些方法包括将可溶性多肽暴露在pH通常高于7且存在特定浓度的离液剂的环境部。离液剂的选择与包含体可溶化中选用的非常相似，但是离液剂通常在低浓度下应用，并且不象可溶化中应用离液剂那样必要。大多数情况下折叠/氧化溶液还包括还原剂或还原剂加上它一定比例的氧化状态的试剂，以产生特殊的氧化还原作用，好允许蛋白质的半胱氨酸桥形成中发生二硫键拖引。常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽(GSH)/二硫GSH，二硫苏糖醇(DTT)/二噻烷DTT，二巯基乙醇(βME)/二硫-β(ME)。许多情况下，为了增加重折叠的效率，可应用助溶剂或助溶剂是必需的。为了达到这一目的而应用的通用试剂包括甘油，不同分子量的聚乙二醇，精氨酸等。衍生物本发明的OPG融合蛋白及其变异体和片段，是通过连接一或多个化学部分而产生的。例如，OPG和Fc多肽的融合可产生在或者OPG部分或者Fc部分，或二者。这些经过化学修饰的衍生物还可进一步调配成动脉内、腹膜内、肌内、皮下、静脉、口腔、鼻、肺、局部或以下讨论的其它途径施用的衍生物。有人发现，生物活性蛋白质的化学修饰在某些条件下具有额外的优势，如提高治疗性蛋白质的稳定性和循环时间，减低其免疫原性。参见U.S.专利号4,179,337。综述见Abuchowski等，Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg和J.Roberts编著，pp.367-383(1981))；Francis等，同上。
适于这种衍化作用的化学部分可选自各种水溶性聚合物。基于这些考虑，如该聚合物/蛋白质缀合物是否用于治疗，如果可以的话，期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抵抗性和其它考虑，该领域的技术人员会选择到所期望的聚合物。对于本发明的蛋白质来讲，衍化作用的有效性可通过以期望的形式(即，渗透泵或更优选地通过注射或输入，或其它制剂，如用于口、肺或鼻施用的)施用衍生物，然后观察这里所描述的生物学活性，来确定。
水溶性聚合物可选自，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三氧己烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(或同源聚合物，或随机聚合物)，葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同源聚合物，聚氧化丙烷/氧化乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇和聚乙烯醇。由于它在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制作中有其优势。琥珀酸和苯乙烯也可应用。此外，多聚氨基酸可选自血清白蛋白(如人血清白蛋白)或其它多聚氨基酸，如赖氨酸。
聚合物可以为任何分子量，可以为分支的或未分支的。对于聚乙二醇来讲，优选的分子量为大约2～100kDa(这里的“大约”表示在聚乙二醇的制备中，一些分子会重于或轻于所讲的分子量)，因为这易于控制和操作。
连接到OPG融合多肽上的聚合物分子的数量不等，该领域的技术人员能够确认对功能的效果。它可以是单体衍生物，或是具有相同或不同化学部位的二聚、三聚、四聚衍生物，或一些衍生物的结合(如不同分子量的聚乙二醇)。聚合物分子与蛋白质(或肽)分子的比率不同，如同它们在反应混合物中的浓度不同一样。通常，最佳比率(指反应的有效率，即没有过量的未反应蛋白或聚合物)由一些因素决定，如所期望的衍化程度(例如单，二-，三-，等)，所选择的聚合物的分子量，该聚合物是否分支或未分支，以及反应条件。
化学部分与OPG融合蛋白的连接要考虑到对蛋白质抗原决定簇或功能的影响。该领域的技术人员可获得有许多连接方法(EP 0401384在此引入作为参考(偶联PEG到G-CSF上)；Malik等，Exp.Hematol.20，1028-1035(1992))(报道用tresyl chloride对GM-CSF进行pegylation)。例如，聚乙二醇通过具有游离氨基(如赖氨酸、精氨酸或N-端的氨基酸残基)或游离羧基(如天冬氨酸，谷氨酸和C-末端的氨酸酸残基)的氨基酸残基而共价结合。也可应用有游离巯基(如半胱氨酸)的氨基酸残基。为了治疗目的，优选的是在氨基端连接，如在N-末端或赖氨酸氨基处连接。如果期望受体介导结合的话，就要避免在受体结合的主要残基处连接。
也许有人特别期望N-末端化学修饰的OPG融合蛋白。以用聚乙二醇作化学部分为例，N末端聚乙二醇化OPG融合多肽的制备可通过在游离的氨基端诱导多肽，并从一群聚乙二醇化的蛋白分子中分离出N-末端聚乙二醇化的物质，而获得。另外，选择性的N-末端化学修饰也可通过还原性烷基化作用来完成，它利用主要氨基(赖氨酸对N末端)不同类型的特异反应性实现特殊蛋白质中的衍化。在适当的反应条件下，可获得含大量在具有羰基的N末端选择性衍化的蛋白质的聚合物。聚乙二醇丙醛，它含有一单个反应性甲醛，也可应用。
用易于制备治疗性的产品，优选N末端单聚乙二醇化衍生物。N-末端的聚乙二醇化的保证了同源产物，其特征为这种产物比相应的二、三或其它多-聚乙二醇化的产物简单化。因易于商业化制作，优选应用上述还原性烷化作用来制备N-末端产物。多肽的应用本发明的融合多肽用于预防和/或治疗骨质损失；预防和/或治疗结构完好的骨骼被结构破坏的骨骼替代；或者预防向骨转移。在包括以下情况在内的多种情况下证明有骨损失骨质疏松，如原发性骨质疏松，内分泌性骨质疏松(甲状腺功能亢进症，甲状旁腺功能亢进症，Cushing′s综合征，和肢端肥大症)，遗传或先天形式的骨质疏松(骨形成不全，高胱氨酸尿，门克士综合征和赖利-戴综合征)，因肢端的不固定而造成的骨质疏松症；成年或幼年出现的骨的佩吉特纳(骨炎)；骨髓炎，或导致骨损失的骨中的感染性损伤；由实体瘤(乳房、肺和肾)和血液系统的恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)导致的高钙血症，自发性高钙血症和与甲状腺功能亢进症及肾功能失常相关的高钙血症；术后、由施用固醇类激素而造成的骨质稀少，以及与大小肠紊乱、慢性肝病、肾脏疾病相关的骨质稀少；与创伤性或非创伤性损伤相关的骨坏死或骨细胞死亡，与戈谢病、镰刀细胞性贫血、系统性红斑狼疮和其它情况相关的骨坏死；因类风湿性关节炎造成的骨损失；牙周的骨损失；骨关节炎；假肢疏松；和溶骨性转移。在成人和幼年的骨佩吉特病(骨炎)，甲状旁腺功能亢进症，先天性骨疾病，如纤维性结构不良，和骨硬化性骨转移中可看到结构完好的骨被结构破坏不完全的骨所替代。
本发明的一实施方案中，本发明的OPG融合多肽由于活性和循环半衰期增加，所以可有益地用于治疗骨损失，尤其是由恶性或转移性肿瘤造成的骨溶性破坏所引起的骨损失。OPG多肽可用于治疗与乳腺、前列腺、甲状腺、肾、肺、食道、直肠、膀胱、宫颈、卵巢和肝脏肿瘤以及胃肠道肿瘤相关的骨损失。还包括与某些血液系统恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤，象何杰金氏疾病这样的淋巴瘤相关的骨损失。
本发明的OPG融合蛋白可单独应用或与其它治疗剂联合应用，特别是与其它肿瘤治疗剂联合应用。通常它们包括放疗或化疗。化疗包括应用一或多种以下试剂进行治疗蒽环类，紫杉酚，三氧苯胺，阿霉素，5-氟尿嘧啶和其它该领域的工作人员已知的药物。在一实施方案中，肿瘤治疗药为促黄体素释放激素(LHRH)拮抗剂，优选肽类拮抗剂。更优选的LHRH拮抗剂为包括以下结构的十肽A-B-C-D-E-F-G-H-I-J其中A为pyro-glu，Ac-D-Nal，Ac-D-Qal；Ac-Sar，或Ac-D-Pal；B为His或4-Cl-D-Phe；C为Trp，D-Pal，D-Nal，L-Nal-D-Pal(N-O)，或D-Trp；D为Ser；E为N-Me-Ala，Tyr，N-Me-Tyr，Ser，Lys(iPr)，4-Cl-Phe，His，Asn，Met，Ala，Arg或Ile；F为 其中R和X是独立地H和烷基；Y包括一小的极性部分；G为Leu或Trp；H为Lys(iPr)，Gln，Met或Arg；I为Pro；J为Gly-NH2或D-Ala-NH2；或其可用作药用的盐。
另一实施方案中，LHRH拮抗剂包括肽N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2。
这里应用的是标准的缩写和规范，下面非标准的残基和部分的缩写如下Nal 3-(2-萘基)丙氨酰基4-Cl-Phe(4′-氯苯基)丙氨酰基Pal 3-(3′-吡啶基)丙氨酰基Pal(N-O)3-(3′-吡啶-N-氧)丙氨酰基iPr-Lys N-ε-2-丙基-赖氨酰基Qal 3-(2′-喹啉基)丙氨酰基LHRH拮抗剂十肽的其它形式也包括在本发明之内。这样的十肽在U.S.专利5,843,901中有所描述，在此引用。
治疗性抗体，包括鼠，鼠-人嵌合的，CDR-移植的，人源化或完全人源的抗体，或者合成的抗体，如那些通过筛选抗体库而选择出的抗体也包括在内。这些抗体的实例包括那些与细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白和肿瘤细胞上存在的表皮生长因子受体(EGFR)结合并能选择性诱导对展露这些蛋白的肿瘤细胞的细胞抑制和/或细胞毒效应的抗体。这些抗体的实例包括治疗乳腺癌的HERCEPTIN和治疗非何杰金氏淋巴瘤的RITUXAN。肿瘤治疗剂中还包括在肿瘤细胞内选择性诱导凋亡的多肽，如TNF相关的多肽TRAIL。OPG融合蛋白可先于肿瘤治疗剂施用，或一起，或随后应用。OPG融合蛋白可预防性施用，以预防或抑制转移性肿瘤造成的骨损失发生，或者用于治疗已存在的由转移造成的骨损失。
本发明的OPG融合多肽可用于预防和/或治疗与多发性骨髓瘤相关的骨损失，或者用于预防和/或治疗该疾病自身。多发性骨髓瘤是B细胞产生的肿瘤，能导致明显的发病率和死亡率。最显著的共有临床表现是由局部区域内破骨细胞活化增加而引起的局部骨损失。大部分骨髓瘤患者(～95％)通常存在破坏性的骨损伤，通过X射线照片分析可以看到的，并且忍受极度的难以控制的骨痛。患有骨髓瘤的病人尤其对患骨的病理性骨折敏感，这经常自然发生或由于旅途受伤造成。骨髓瘤过程中发生的骨骼损伤不仅可导致骨折，而且可造成畸形，偶然会造成神经压迫，尤其是发生在脊椎动物的脊柱时。在一些患者中发生血清中钙病理性增加(高钙血症)，并且在疾病的治疗过程中可引发显著的问题。OPG可施用给病人以阻断骨吸收和钙的释放，由此减低骨折和脊柱变形的危险。
骨髓瘤细胞不直接参与骨破坏，但是它产生细胞外信号导致破骨细胞分化和活化。然后破骨细胞在体内制造最高水平的任何细胞类型的细胞因子IL-6，尤其是当它们被活化时。IL-6是B细胞的生长因子，体外小鼠和人骨髓瘤细胞的生长都需要它。TNF相关蛋白OPG配体(OPGL)负责诱导破骨细胞分化和活化(见WO98/46751)。骨髓瘤细胞直接地或间接地给破骨细胞制造该因子，导致包埋在骨髓内的骨髓瘤细胞周围的局部骨溶解。邻近骨髓瘤细胞的正常破骨细胞依次产生IL-6，导致肿瘤细胞的局部扩展。骨髓瘤细胞以集落的方式扩展并占据由不正常骨吸收而制造的骨骼空间。
已观察到在啮齿动物中施用OPG会诱导破骨细胞群的快速死亡。破骨细胞的减少会消除破骨细胞引起的IL-6产生增加，并影响骨小梁内骨髓细胞的生存和生长。因此，OPG治疗骨髓瘤患者不仅阻断骨的高吸收，而且可影响肿瘤自身的生存和扩展。已知B细胞表达OPGL受体，称为破骨细胞分化和活化的受体，或ODAR。骨髓瘤细胞也表达ODAR，此外也产生OPGL。同一种细胞上共表达OPGL和ODAR会产生一种自分泌性刺激，这种刺激影响着骨髓瘤细胞的生存。因此，OPG治疗可直接影响肿瘤细胞生存，由此减低或消除在骨髓瘤患者中见到的肿瘤负荷。药物组合物本发明还提供包括OPG融合蛋白和其变异体、片段和衍生物的药物组合物。该药物组合物可注射施用，或经口、肺、鼻、经皮施用，或以其它形式施用。总体上讲，本发明包括的药物组合物包括有效量的本发明的OPG融合蛋白，还有药学上可接受的稀释剂，防腐剂，助溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。有效或治疗有效量的OPG融合蛋白是用这里描述的方法或程序确定时，它的量足以减低骨损失率和/或程度。
本发明的药物组合物包括不同缓冲体系(如Tris-HCl，醋酸，磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；象去污剂和助溶剂(如吐温80，聚山梨醇醋80)这样的添加剂，抗氧化剂(如抗坏血酸，焦亚硫酸钠)，防腐剂(如硫柳汞，苄基乙醇)和填充剂(如乳糖，甘露醇)；整合这些物质到特殊聚合物化合物的制备中，如聚乳酸，聚羟基乙酸中，或整合到脂质体中。也可应用透明质酸，它具有促进在循环中保留过程的作用。这些组合物可影响本蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内的释放率和体内的廓清率。参见，如Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)1435-1712。组合物可以制备成液体状或制备成干粉，如冷冻干燥形式。也可考虑可植入的缓释制剂，如经皮制剂。
这里考虑应用的为口服固体形式，这在Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.1990(Mack Publishing Co.，EastonPA 18042)，第89章中有整体论述。固体剂量形式包括片剂、胶囊、丸剂、锭剂或糖锭，扁囊剂或小丸。脂质体或类蛋白质的包裹也可用于配制本发明的组合物(例如，U.S.专利4,925,673中报道的类蛋白质的微球)。可应用脂质体包裹，脂质体可以与不同的聚合物修饰(如U.S.专利5,013,556)。用于治疗的可能的固相剂量形式的描述由Marshall K.在Modern Pharmaceutics Edited by G.S.Banker和C.T.Rhodes，第10章，1979描述，在此引用作为参考。总之，制剂要包括OPG融合蛋白或其变异体、片段或衍生物，以及惰性成分，它们能在胃环境中保护并在肠中释放生物活性物质。
OPG融合蛋白可经过选择性地化学修饰，这样衍生物的经口给药是有效的。通常考虑的化学修饰是至少一部分连接蛋白质(或肽)分子自身，这里所讲的部分允许(a)抑制蛋白水解；(b)从胃或肠道摄取入血流。同时期望蛋白质的整体稳定性增加及在体内的循环时间增加。这样的实体实例包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚体，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts.于《Enzymesas Drugs》，Hocenberg和Roberts编辑，Wiley-Interscience，New York，NY，(1981)，pp 367-383；Newmark等，J.Appl.Biochem.4185-189(1982)。可应用的其它聚合物为聚1，3-二氧杂环己烷，和聚1，3，6-三氧杂环己烷。如上所述，用于药物时优选聚乙二醇部分。
为了保证口服后能抵抗胃中的降解，至少在pH5.0不渗透的包衣是必要的。用作口服制剂肠衣的较常见的内在成分有纤维素醋酸三苯六甲酸酯(CAT)，羟丙甲基纤维素酞酸酯(HPMCP)，HPMCP 50，HPMCP 55，聚乙烯醋酸酞酸酯(PVAP)，Eudragit L30D，Aquateric，纤维素乙酸酞酸酯(CAP)，Eudragit L，Eudragit S，和Shellac。这些包衣以混合的膜应用。
OPG融合蛋白以大约1mm的粒或小丸颗粒形式作为精细的多重颗粒包括在制剂中。用于制成胶囊施用的物质的配方也可是粉末，经压上塞子或用作片剂。
本发明的药物组合物包括稀释剂，包括碳水化合物，尤其是甘露醇，α-乳糖，脱氢乳糖，纤维素，蔗糖，修饰过的葡聚糖和淀粉。一些无机盐，包括三磷酸钙，碳酸镁和氯化钠可用作添加物。商品性的稀释剂有Fast-F10，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
固体剂配方中可包括崩解剂。用作崩解剂的物质有但并不限于淀粉，包括以淀粉为基础的商品性崩解剂Explotab。Sodium starchglycolate，Amberlite，羧甲基纤维素钠，ultramylopectin，藻酸钠，明胶，橙皮，酸性羧甲基纤维素，天然海绵和皂土均可应用。另一种形式的崩解剂为不溶性的阴离子交换树脂。成粉状的树胶可用作崩解剂和粘合剂，它们可包括琼脂、卡拉牙胶或西黄蓍胶样的粉末状树胶。藻酸及其钠盐均可用作崩解剂。
粘合剂可用于形成硬的片剂，包括天然产物，如金合欢胶，西黄蓍胶，淀粉和明胶。其它的包括甲基纤维素(MC)，乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羧丙甲基纤维素(HPMC)均可用于醇溶液中使治疗药物成粒。
加入到配方中的润滑剂包括但并不限于包括其镁盐和钠盐的硬脂酸，聚四氟乙烯(PTFE)，液态石蜡，植物油和蜡。可溶性的润滑剂，如十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸镁，各种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000也可应用。
促滑剂在制剂过程中可提高药物的流动特性，并在加压过程中帮助重排。促滑剂可包括淀粉、滑石粉、致热的硅石和水合的硅铝酸盐。
为了帮助OPG融合蛋白的溶解，可加入表面活性剂作为加湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠，二辛基磺酸钠。可应用阳离子去污剂，它包括苯扎氯铵或氯苄乙铵。非离子去污剂的清单中有表面活性剂Lauromacrogol 400，聚乙二醇40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10，50，60，甘油单硬脂酸酯，聚山梨醇酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独和以不同比率的混合物存在于蛋白质或衍生物的制剂中。
大大增加蛋白摄取的添加剂是，例如脂肪酸，油酸，亚油酸和亚麻酸。
期望一控制释放的制剂。OPG融合蛋白可被整合到一惰性基质中，这允许它以扩散或浸沥机制释放，如树胶。缓慢降解的基质也可被包含到制剂中，如藻酸盐、多糖。另一种控制该治疗剂释放的形式是通过以Oros治疗系统(Alza Corp.)为基础的一种方法，即药物被包到一半渗透性膜中，它能允许水进入，通过渗透压作用将药物从单个小孔中挤出。一些肠衣也具有缓释效果。
其它包被物可用于制剂中。如，膜包被的片剂可包括2组不同的物质。第一组物质包括非肠溶性物质，如甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，Proridone和聚乙二醇。第二组包括通常为酞酸酯的肠溶物质。可应用这些物质的混合物以提供最佳的包衣。膜包被可在一盘状包被仪中进行，或在液化床中，或通过压力包被。
同样需要这里考虑的是OPG融合蛋白或多肽在肺中输送。蛋白通过吸入传输到肺，横穿肺上皮细胞进入血流。(其它报道有Adjei等，Pharmaceutical Res.，7565-569(1990)；Adjei等，Int.J.Pharmaceutics 63135-144(1990)(leuprolide acetate)；Braquet等，J.Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)s.143-146(1989)(内皮素-1)；Hubbard等，Annals of Internal Medicine3206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.841145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等“Aerosolization of Proteins”，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，1990(重组人类生长激素)；Debs等，J.Immunology1403482-3488(1988)(IFNα和TNFα)和U.S.专利5,284,656(G-CSF)。
实施本发明应用的是为治疗药物的肺传输而设计的大范围的仪器设备，它们包括但不限于喷雾器，计量化的剂量吸入器，粉末吸入器，所有这些都是该领域的技术人员熟悉的。适于实施本发明的商品化装置的一些特殊例子为Ultravent喷雾器，Mallinckrodt Inc.生产，St.Louis，Missouri；Acorn II喷雾器，Marquest Medical Products生产，Englewood，Colorado；Ventolin仪表控制剂量的吸入器，Glaxo Inc.生产，Research Triangle Park，North Caroliua；Spinhaler粉末吸入器，Fisons Corp生产，Bedford，Massachusetts。
所有这些装置要求应用适于OPG融合蛋白及其变异体、片段或衍生物调配的制剂。传统地，每一种制剂对所用的仪器类型特异，除应用治疗中应用的稀释剂、佐剂和/或载体外，也可用到适宜的推进剂。
要将OPG融合蛋白最有利地制备成平均值小于10μm(或微粒)的颗粒，最优选的是0.5～5μm大小，因为这样能最有效地输送到肺远端。
载体包括碳水化合物，如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。制剂中应用的其它成分包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可应用天然的或合成的表面活性剂。可应用聚乙二醇(不同于在诱导蛋白质或类似物衍化中的应用)。葡聚糖，如环葡聚糖也可应用。胆汁盐和其它相关的增强物可应用。可应用纤维素和纤维素衍生物。可应用氨基酸，如在缓冲液配方中应用、也可考虑应用脂质体、微胶囊或微球，包含体，或其它类型的载体。
也可考虑鼻腔输送OPG融合蛋白。鼻腔输送允许将治疗性产物施用给鼻后，蛋白直接入血流，而不需要将产物吸入到肺中。用于鼻腔输送的制剂包括那些应用葡聚糖或环葡聚糖的。也考虑通过其它粘膜进行转运。剂量施以治疗有效量的本发明的OPG融合多肽来预防和/或治疗与转移性骨疾病相关的骨损失。“治疗有效量”的OPG融合多肽是指可减少骨质损失的量。骨质的检测可通过各种已知的方法进行，如单光子吸收仪(SPA)，双光子吸收仪(DPA)，双能量X射线吸收仪(DEXA)，定量的计算机体层扫描(QCT)和超声波检查仪(参见Johnston等，于《Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of MineralMetabolism》第2版，M.J.Favrus编辑，Raven Press，pp.237-146)。该领域的技术人员应用这些方法可确定OPG融合多肽的治疗有效量。也可通过检测骨中化学性标记物的改变来确定，如血清中的骨钙素，血清碱性磷酸酶，血清I型原胶原延展肽，尿或血清中胶原的C末端或N末端端肽，尿钙，羟脯氨酸和尿吡啶啉和脱氧吡啶啉。人们认识到前面提到的化学性标志物水平的降低提示骨吸收降低且骨损失正在减少。另外可通过测定骨强度的增加，尤其是骨扭转强度的增强来确定OPG融合多肽的治疗有效量。
总体而言，OPG融合多肽的治疗有效量从大约0.1mg/kg到10mg/kg，优选从1mg/kg到10mg/kg。由于OPG融合多肽的半衰期增加，尤其是OPG融合到免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，所以它们的施用不象未经修饰的OPG多肽那么频繁，其施用频率为大约每月一次，或者每两个月一次，或每三个月一次。该领域的技术人员会赞同其准备的剂量和施用频率要取决于几个因素，包括剂型，施用途径，被治疗的病情等等，工作人员会很容易地确定。
所施用的OPG融合蛋白的量可应用融合蛋白的诊断性检测方法来确定。这样的诊断性检测方法可以为抗体检测形式，如抗体夹心法，其中抗体与OPG融合蛋白特异性结合，而不与内源的天然循环着的OPG或与OPG融合也可自然循环着的异源蛋白，如自然循环着的抗体的Fc区结合。可应用该领域的技术人员已知的多种以抗体为基础的检测模式进行OPG融合蛋白水平的测定。
提供以下实施例对本发明进行更全面地阐述，但本发明并不仅限于其范围。
实施例1OPG融合多肽的构建及表达用于制备相应OPG融合多肽的编码OPG[1-194]-Fc、OPG[1-201]-Fc、OPG[1-194]-FcΔC、OPG[1-201]-FcΔC、OPG[1-194]-FcG10和metFcΔC-OPG[22-194]的质粒构建大体按WO 97/23614和共同未决的美国专利申请序列号＿＿，申请日1999 9月＿。二者中论述的。二者在此均作为参考。多肽的序列分别示于图3-8。
OPG融合多肽哺乳类和细菌宿主细胞的表达大体按WO97/23614进行。
实施例2在乳腺癌模型中OPG活性对溶解性骨病的作用将人MDA-MB-231乳腺癌细胞(1.0×105细胞/鼠，ATCC#HTB-26)直接通过左心室注入到7-8周龄雌性Balb/c nu/nu小鼠的全身循环中。肿瘤接种之后立即给小鼠静脉注射磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)或met FcΔC-OPG[22-194](25 mg/kg)，每周3次，共4周。通过X光照来估计损伤数/鼠。按下面描述的那样用组织学方法来评价骨、心脏、肺、肝、肾、肾上腺、卵巢、大脑、胰腺和脾脏中存在的肿瘤灶。
如图9所示，接种MDA-MB-231细胞4周后在长骨出现明显的放射线照片上的损伤。接种的同时静脉内施用剂量为25mg/kg的metFcΔC-OPG[22-194]，每周3次，可完全抑制相关的骨破坏(6.2±0.8vs 0.0±0.0损伤/鼠，p＜0.001)。
实施例3OPG在小鼠腺癌模型中对溶解性骨病的活性将鼠C26-DCT腺癌细胞(来自国立癌症研究所的肿瘤储存库，1.0×105细胞/鼠)从左心室直接注入到7-8周龄雌性CDF1小鼠的全身循环系统。肿瘤接种后立即静脉内注射或者PBS或者met FcΔC-OPG[22-194](25mg/kg)，每3天1次，共9天。在第10天给小鼠进行X射线照片，取组织样进行组织学评估。
如图9所示，心内接种C26-DCT细胞后10天射线照片性损伤很明显(3.1±0.6损伤/鼠)并且骨破坏被静脉内注射FcdC-OPG[22-194]抑制。
在另一研究中，如上给小鼠接种C26-DCT细胞，静脉内注射PBS或met Fc-OPG[22-194]，剂量为3，1，0.3，或0.1mg/kg，每3天1次共9天。在第10天对小鼠进行X线照片。对X线片进行分析，对组织进行如下处理。经静脉内met FcΔC-OPG [22-194]治疗X线摄影的损伤以剂量依赖性方式减轻。(图10)。
实施例4OPG在小鼠腺癌模型中对高钙血症的活性10-12周龄的雄性Balb/c×DBA/2(DCF1)小鼠购自HarlanSprague Dawley(San Diego，CA)或Charles River(Wilmington，MA)。
C-26肿瘤，最初是通过直肠内反复滴注N-亚硝基-N-甲基乌拉坦(NMU)而在雌性Balb/c小鼠中诱导的(Corbett等，Cancer Res，35，2434-2439(1975))。以组织碎片的形式获自国立癌症研究所的肿瘤储存库。机械性破碎组织碎片，在标准的组织培养条件(37℃、5-6％CO2)下培养，这样产生能不断繁殖的贴壁细胞系，随后冻存。体外传代用的培养基是DMEM，加10％FCS，1×青链霉素/谷氨酰胺和1×非必须氨基酸。所有实验的开始应用公共储存的独立冻存管的细胞。复苏培养后，用胰化消化后收集细胞，然后洗几次，重悬在没有添加物的DMEM中，使浓度达2.5×106细胞/ml。在剃毛了的右侧区给动物皮下(SQ)注射0.2cc(0.5×106细胞)。可以发现在这些情况下肿瘤生长非常一致，差异最小。
治疗在第8天(预防研究)开始或者当血离子钙水平达到＞1.60mmol/L时(治疗研究)开始。在预防性研究中治疗持续8天，在治疗性研究中持续4天。在预防性研究中met FcΔC-OPG[22-194]每天施用，它以PBS为载体，皮下注射到腹侧区。治疗研究中，met FcΔC-OPG [22-194]在PBS中单次静脉内注射施用。在两组研究中正常和荷瘤对照动物均接受同样的PBS注射。
在研究过程中，给小鼠每天称重(治疗时)，在预防研究中隔天监测血离子钙水平(当天施用药物以前)，在治疗组中每天监测。球后取血，应用血离子钙/pH分析仪(Chiron Diagnostics#634，Norwood，MA)测定血清离子钙。组织学评估在研究结束的时候从每一动物收集一条腿(股骨和胫骨连接的)。骨头在磷酸缓冲的锌溶液配制的福尔马林中固定，蚁酸中脱钙，石蜡包埋。在股骨远端和胫骨近端的中间区域进行切片，反应以证明酒石酸抗性的酸性磷酸酶活性(TRAP)，用苏木素复染。在染色过程中，破骨细胞被染成红色，而其它类型的细胞、骨和软骨被染成不同程度的兰色。
计算是应用Osteomeasure骨分析程序(Osteometrics Inc.，Decatur，GA)，在刚好远离胫骨近端生长盘(在主要的骨松质区)的区域，以及与第一次测量区域2mm远的胫骨皮层体区测量。选择胫骨两个不同的区域进行测量以准确测定肿瘤诱导的骨吸收增加。测量的范围在每一部位均包括1mm×1mm平方面积，但在第一次测量区内不包括生长盘。测量的指标是破骨细胞和骨表面的数目和活性表面。结果记录为破骨细胞数目(OcN)，破骨细胞周长(活化的破骨细胞表面)(OcPm)，骨周长(骨表面)(BPm)。破骨细胞要被计算在内的话它必须是TRAP阳性并且与骨表面连接。所有的计算是在安装在显微镜上的转写器的帮助下，将切片中的图像转变成数码平台进行的。结果OPG治疗缓和C-26腺癌对体重损失的作用。每天接受2.5mg/kgOPG治疗的小鼠损失的体重平均为5.2g，而未经治疗的荷瘤鼠平均损失6.2g。PBS荷瘤鼠的肿瘤为3.47±0.72％而OPG 2.5mg/kg的为3.42±0.82％。重量为PBS 0.75±0.14g，OPG 2.50.79±0.16g。OPG预防并逆转C-26肿瘤诱导的血离子钙水平增高当肿瘤移植后9天开始治疗时，OPG剂量依赖性地抑制肿瘤诱导的全血离子钙水平的增加(见图11A)。在OPG开始治疗前，荷瘤鼠全血离子钙水平轻微增加(1.34±0.06mmol/L对1.25±0.02mmol/L)。在溶剂治疗组，其水平在整个实验过程中持续增长，最大值为1.84±0.12mmol/L，在第13和15天达到，在第16天轻微下降。OPG治疗组证实在整个治疗阶段，它剂量依赖性地抑制全血离子钙水平的增加，在2.5mg/kg组，第15天的离子钙水平最高达1.38±0.06mmol/L。这种钙离子中度但明显高于非荷瘤对照鼠的水平。OPG治疗在非荷瘤小鼠中对钙水平无效。
当在治疗前允许小鼠自然发展为高钙血症时，单独5.0mg/kg的OPG能快速降低钙水平，12小时证明有显著下降，治疗24h内达到血钙正常(见图11B)。在持续进行的实验研究中，OPG维持血钙在正常水平。OPG预防并逆转C-26肿瘤诱导的破骨细胞在线的骨表面和破骨细胞增加破骨细胞在线的表面和破骨细胞数目在荷C26肿瘤的高钙血症小鼠中也进行了显著性评估。用2.5mg/kg的OPG蛋白治疗，无论先于高钙血症发生或是发生之后进行治疗，均能引起破骨细胞的几乎彻底消失。破骨细胞表面测量，是骨吸收量的指示，在