专利名称：酿酒酵母菌株及筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法目前，资源、能源形势问题已经受到世界范围的关注，寻找有发展前景的环境友好的资源、能源是满足未来社会可持续发展的必要条件。木质纤维素资源年产量巨大，可以作为潜在的燃料和化工产品生产原料，各种相关的生产技术的研究极为广泛，并且在近几年取得了很多技术上的突破。木质纤维素的主要成分为纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)及木质素(Iignin)三部分。纤维素是由葡萄糖残基经β_1，4糖苷键连接成的不分支结晶状多聚体；半纤维素是包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等多种糖分的非结晶异质多聚体。木质纤维素原料水解后，木糖在水解液中含量可达到总糖的30%，其有效利用是提高木质素原料利用率，降低产品生产成本的关键之一。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)是广泛使用于食品及化工工业的生产菌株，具有抗逆性强、 发酵条件易控制、遗传背景清楚、食品级安全等许多优良特性，是良好的工业生产菌株。尽管酿酒酵母能够有效发酵木质纤维素水解液中的葡萄糖，但是天然的菌株并不能发酵在木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的木糖，必需对酿酒酵母进行进一步的遗传改造。木糖代谢途径的引入可以使酿酒酵母利用木糖，但是，木糖摄取效率较低且摄取过程受葡萄糖抑制， 使摄取过程成为限制酿酒酵母对木糖利用的主要障碍之一。天然的酿酒酵母通过非特异性己糖转运蛋白(主要有^^1、^^2、^^4、^^5和^{7)和半乳糖透性酶(GaU)摄取木糖，这些转运蛋白都属于Major Facilitator Superfamily(MFS)转运蛋白，对木糖的亲和性较低，其Km值是相对于葡萄糖的10 100倍。部分外源的木糖转运蛋白在酿酒酵母中的表达，可以促进菌株对木糖的利用，例如，来源于间型假丝酵母(Candida intermedia)的 Gxfl、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的 Sutl 和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的 At5g5920等，但它们对木糖的亲和力仍远小于对葡萄糖的亲和力，不能满足构建高效木糖利用重组酿酒酵母的需求。筛选在酿酒酵母中高亲和性木糖专一性转运蛋白，并在酿酒酵母中表达相应蛋白，仍旧是提高酿酒酵母木糖利用的重要实施手段之一。此前主要有两种方式筛选和研究在酿酒酵母中有功能的木糖转运蛋白。一种方法是将转运蛋白库引入带有木糖代谢途径的酿酒酵母菌株中，通过菌株在木糖上生长能力是否有改进，判断转运蛋白的功能强弱，但是，这种方法获得的假阳性结果过多，且无法定量。 另一种方法是将引入转运蛋白库的菌株在同位素标记的木糖中孵育，测定菌株对木糖的运输能力，这种方法有潜在危险性，操作复杂，对操作人员和设备的要求都很高。因此，建立一种可以定量检测的高通量木糖转运蛋白筛选方法是十分必要的。对硝基酚木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)是一种木糖结构类似物。β-木糖苷酶可以将PNPX水解，产生等摩尔的对硝基苯酚(pNP)和木糖分子。pNP 在碱性条件下显示黄色，并在405nm处表现最大吸收峰。由于β -木糖苷酶催化的反应速率以及PNP扩散出细胞的速率都远远高于细胞运输木糖或者ρΝΡΧ的能力，因此pNP的生成速率反映了进入细胞的PNPX的摄取速率。通过在大肠杆菌中表达β-木糖苷酶，这种筛选木糖转运蛋白的方法已经在大肠杆菌中建立。但是由于表达体系的不同以及细胞结构的不同，在酿酒酵母中相关工作存在一定难度酿酒酵母为真菌，其细胞壁和细胞膜成分比细菌复杂，可能会造成分子的出入胞困难；酿酒酵母和大肠杆菌的木糖转运机制不同；酿酒酵母细胞要比大肠杆菌大一个数量级，沉降系数较大，对读值干扰大，造成难以带菌体实时监测；野生型酿酒酵母不存在有效的木糖代谢下游基因，其对木糖的转运和利用速率明显低于大肠杆菌，造成PNPX微量检测的困难，对操作人员和设备的要求较为苛刻，此方法在酵母中的成功建立至今未见报道。
针对上述现有技术，本发明提供了一株能表达木糖苷酶的酿酒酵母菌株，并提供了一种用于筛选表达了有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，还提供了一株经该方法筛选得到的表达有高活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株。本发明是通过以下技术方案实现的一株表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2AB，分类命名为酿酒酵母&iccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 5465。其菌学特征为CEN. HQ02-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3-52, pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在， 固体培养时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、粘稠，呈乳白色。该菌株能够高水平的胞内表达有活性的β -木糖苷酶，与普通的酿酒酵母菌株相比较，其为Ieu和ura双缺陷型单倍体菌株，可以实现IeiT和ura_标记的附加体质粒的共表达，本菌株用(IeiT)附加体质粒高效表达了木糖苷酶基因，可以与克隆了转运蛋白基因的ura—标记的附加体质粒共表达，达到筛选转运蛋白基因的目的。该菌株是发明人通过重组构建并筛选得到的。一种筛选能表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，步骤如下(1)菌株培养将待检测菌株和常规菌株分别进行常规培养，得菌液；(2)将上述培养得到的菌液离心去掉培养基，然后用磷酸盐缓冲液重悬，得细胞重悬液；(3)向上述细胞重悬液中加入木糖结构类似物ρΝΡΧ(对硝基苯-β -D-木糖苷)， 孵育后离心取上清，加入等体积的Na2CO3溶液，测定405nm处光吸收值OD4tl5nm ；(4)建立pNP在405nm处光吸收值-pNP含量标准曲线以及菌液OD-^值-细胞干重标准曲线，结合步骤⑶测得的OD4tl5nm，计算得到转运蛋白对ρΝΡΧ的转运速率(用完整细胞测得的酶活)；(5)判断对比待检测菌株的转运速率与常规菌株的转运速率，若待检测菌株的4转运速率高于常规菌株的转运速率，则证明该待检测菌株表达的木糖转运蛋白为能提高酿酒酵母菌株木糖转运能力的蛋白，差值越大，说明该待检测菌株表达的木糖转运蛋白转运木糖的能力越高；若待检测菌株的转运速率不高于常规菌株的转运速率，则证明该待检测菌株没有表达能提高酿酒酵母木糖转运能力的蛋白。所述待检测菌株可以是通过以下方法构建的(1)表达载体构建建立包含有待筛选转运蛋白基因的重组载体；(2)重组菌株构建将步骤(1)中建立的重组载体转化到胞内表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即为待检测菌株。所述待筛选转运蛋白基因可以来自各种来源，比如来自植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) ^$1 AraT0所述构建表达载体所用的质粒为pJFE3(YEplacl95，TEFp-PGKt, Ura，Amp+)空质粒(该质粒是现有技术中已有的)。所述转化方法为醋酸锂转化法。所述筛选成功转化子的方式为用添加2%葡萄糖(质量分数)的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura (该培养基是现有技术中已有的)筛选正确的转化子。所述常规菌株为不含有待筛选转运蛋白基因的胞内表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株。所述建立ρΝΡ在405nm处光吸收值-pNP含量标准曲线的方法为根据pH6. 5的 PBS液配制梯度浓度的pNP，并测定405nm处光吸收值OD4tl5nm,建立标准曲线；所得标准曲线方程为y(QD4Q5mi) = 0. 0916x(pNP/nmol)+0. 0735，χ 取值范围优选在 1. 5-7. 5。所述建立菌液OD6tltlnm值-细胞干重标准曲线的方法为取培养的菌液，离心水洗， 抽滤、烘干后测定干重；稀释六个水平，根据稀释倍数计算干重并测量相应OD6tltl ；在实验中直接测定的是菌液的0D·，根据此公式可以具体算出每毫克干重细胞的转运速率；所得标准曲线方程为:y(mgdw/ml) = 0. 2365x(oD600nm)1149，χ取值范围优选在1-22。所述“待检测菌株的转运速率高于常规菌株的转运速率”是指待检测菌株转运速率高出常规菌株转运速率的18. 5%，此时为显著高于。上述筛选能表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，也可以用于筛选能在酿酒酵母中高活性运输木糖的转运蛋白。通过上述方法，本发明还获得一株高木糖转运能力的重组酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 5464。该菌株表达了克隆自植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)的转运蛋白基因AraT，其木糖转运能力较普通酿酒酵母菌株提高了一倍以上。可以预见，该菌株在利用含木糖原料生产其他产品领域中具有广阔的用途，比如以该菌株为出发菌株，引入木糖代谢途径，可以构建具有高水平利用木糖能力的重组菌株。本发明的方法中，用于筛选转运蛋白的反应底物是木糖结构类似物——对硝基苯-β-D-木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)，如图 1 所示；待筛选转运蛋白基因是通过酿酒酵母表达载体引入酿酒酵母菌株的；转运蛋白对PNPX的转运速率由PNPX被β-木糖苷酶水解获得的产物硝基苯酚(p-nitr0phen0l，pNP)生成速率来界定；pNP生成速率由pNP引起的反应液吸光度变化速率来计算；转运蛋白对木糖的运输能力通过转运蛋白对PNPX运输效率来间接界定。本发明的方法可有效避免假阳性情况的出现，并且可以定量描述菌株转运木糖的能力，操作不存在危险性，操作步骤简便，对操作人员和设备的要求不苛刻，具有通用性。
菌株BSW2AB，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5465, 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。菌株BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年 11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. M64，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101。图1是酿酒酵母木糖转运蛋白的高通量筛选方法原理示意图。本方法将木糖转运蛋白的活性和在胞内表达的木糖苷酶相关联，利用木糖结构类似物对硝基酚木糖苷(p-nit rophenyl- β -D-xylopyranoside, ρΝΡΧ)代替木糖进行定量分析。与酿酒酵母完整细胞进行孵育的PNPX在木糖转运蛋白的作用下进入胞内，被木糖苷酶迅速水解为对硝基苯酚(pNP) 和木糖，pNP可以快速扩散至胞外，在碱性条件下显示黄色，并在405nm处表现最大吸收峰。图2是酿酒酵母附加体穿梭质粒p^^42-PGKt-TEFp-XynB示意图。其中木糖苷酶基因(xynB)克隆自短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，在酿酒酵母TPIp启动子控制下表达。图3是酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3-araT示意图。其中，转运蛋白araT克隆自植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)，在酿酒酵母TEFp启动子控制下表达。
4 ^ BSW2ABP(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3， ura3-52, pYX242-PGKt-TEFpTPIp-xynB-PGKt,pJFE3)基因工程改造菌株的胞内外和完整细胞状态下测定的木糖苷酶酶活。其中□代表BSW2ABP菌株；1、2、3分别代表培养10小时(初始OD6tltlnm 为0.5)时细胞破碎液中测得的木糖苷酶酶活(即，细胞内木糖苷酶活性)；和细胞分离后， 培养液中的木糖苷酶酶活(即，细胞分泌到细胞外的木糖苷酶活性)；和培养液分离后，未经破碎的细胞能够测定到的木糖苷酶酶活(即，利用完整细胞测定时可以测到的木糖苷酶活性)。木糖苷酶酶活iu定义为Imin内分解ρΝΡΧ生成的pNP的微摩尔数(μ mol)。细胞内木糖苷酶活性较高，证明木糖苷酶在酿酒酵母中的高效表达；细胞分泌到细胞外的木糖苷酶活性很低，几乎检测不到，证明此木糖苷酶是胞内酶；利用完整细胞测定时可以检测到木糖苷酶酶活，证明了此种检测方法的可操作性，同时，其结果远小于(相差100倍以上) 细胞内的木糖苷酶活性，证明进入细胞的PNPX可以被木糖苷酶迅速水解，酶解过程是非限速步骤。图5是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，所测定的OD4tl5nm读值与孵育时间之间的对应关系。证明取两个时间点的数据来间接表征整个动力学过程趋势的合理性。其中， BSW2ABP菌株培养1釙。图6是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，不同孵育时间的pNP生成速率(即转运蛋白的转运速率)。不同孵育时间(60min以内)下所得的pNP生成速率基本一致，证明可以用某个时间点的PNP生成速率来表征初速率。其中，BSW2ABP菌株培养15h。图7是菌株BSW2ABP在完整细胞状态下，胞内的和扩散至胞外的pNP含量的测定结果。其中，1、2分别代表BSW2ABP菌株孵育IOmin和30min的实验结果；口代表胞内的pNP 量，■代表扩散至胞外的pNP量；BSW2ABP菌株培养15h。胞内的pNP量远小于(相差近20 倍)扩散至胞外的PNP量，证明胞内生成的pNP可以迅速出胞，此步骤是非限速步骤。图 8 是菌株 BSW2ABT(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3_52， pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3_araT)的 pNPX 运输能力测定结果。其中，□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABT菌株；菌株培养时间为10h。超表达araT的菌株其木糖运输能力显著增强，比对照菌株提高了 1. 06倍。图9是检测菌株BSW2ABP和BSW2ABT转运pNPX和不同浓度木糖之间的竞争关系。 其中，□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABT菌株；菌株培养时间为10h。随着胞外木糖浓度的提高，两株菌的PNPX的利用速率呈下降趋势，而且BSW2ABT菌株下降趋势更明显，证明无论对于酿酒酵母内源性木糖转运蛋白还是AraT而言，pNPX和木糖之间均存在竞争关系， 是底物类似物，因此，转运蛋白转运PNPX的效率可以反应其转运木糖的效率。图10是在两菌株BSW2ABP和BSW2ABT竞争关系测定实验中，转运pNPX初速率倒数和不同浓度木糖之间的线性关系。在竞争性关系的米氏方程中，特定底物的初速率倒数和竞争性底物浓度之间存在线性关系。实验中测定的BSW2ABP和BSW2ABT菌株转运pNPX 初速率倒数和不同浓度木糖之间的线性关系拟合均较好，R2 = 0. 925和0. 942，进一步证明了 pNPX是木糖的竞争性底物。其中，▲代表BSW2ABT菌株； 代表BSW2ABP菌株；菌株培养时间为10h。

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方法如下(1)选用实施例1步骤(4)中培养15小时的菌液，离心(3000r · min^,5min)去掉原培养基后用PH6. 5的50mmol/L PBS液重悬；(2)孵育时间和转运速率测定值之间的关系测定用96孔平板或EP管取适量步骤(1)中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，随后置于30°C，200r · mirT1摇床中，分别孵育10min、20min、30min、40min、50min和60min，离心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等体积的0. 4mol/L的Na2CO3水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定孵育后生成的对硝基酚(PNP)的光吸收值。孵育初始值测定时，加入pNPX后立即离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100 μ 1，再加入100 μ 1的0. 4mol/ L的碳酸钠水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定光吸收值。测定得到OD4tl5nm读值和孵育时间之间的对应关系，见图5 ；根据pH6. 5的PBS液配制的pNP标准曲线y(OT4(15nm)= 0. 0916x(pNP/miol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6tltlnm值和细胞干重的对应关系y(mgdw/ml)= 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到，在60分钟内，孵育时间不影响转运速率值，见图6。实施例3 完整细胞测定状态下，pNP胞内外含量的测定方法如下(1)选用实施例1步骤(4)中培养15小时的菌液，离心(3000r · min^,5min)去掉原培养基后用PH6. 5的50mmol/L PBS液重悬；(2)完整细胞测定状态下，pNP胞外含量的测定用96孔平板或EP管取适量步骤 (1)中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，随后置于30°C，200r ^irT1摇床中， 分别孵育IOmin和30min ；离心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等体积的0. 4mol/ L的Na2COyK溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定孵育后生成的对硝基酚(pNP)的光吸收值。孵育初始值测定时，先不加PNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100 μ 1，再加入100 μ 1的0. 4Μ的碳酸钠水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定光吸收值；根据ρΗ6. 5的PBS液配制的pNP标准曲线= 0. 0916x(pNP/nmol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6tltlnm值和细胞干重的对应关系 y(mg dw/mi) = 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到胞外 pNP 的含量，见图 7 ；(3)完整细胞测定状态下，pNP胞内含量的测定取⑵中孵育IOmin和30min的完整细胞测定后的菌泥，经Iml的PBS快速洗后加入408 μ 1的0. 2mol/L的碳酸钠溶液，0. 2g 玻璃珠，6000rpm, 30s，用组织勻浆器破碎细胞4次，离心，用96孔平板取200 μ 1在405nm处测定读值，根据PH6. 5的PBS液配制的pNP标准曲线Yto4tl5nm) = 0. 0916x(pNP/miol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6tltlnm值和细胞干重的对应关系y(mg dw/ml) = 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到胞内的pNP含量，见图7。实施例4 =AraT的克隆和菌株BSW2ABT的pNPX运输能力的测定方法如下(1)菌种选择选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)的实验室菌株 BSW2AB(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3-52, pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受体株菌；(2)表达载体构建用上下游引物 AraTup 5，-CGCGGATCCATGAATAAGCAGAAAA AGGTTT-3，和 AraTdown :5，-ACGCGTCGACTTAATGACTCGCTTGTTGTACG-3‘从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DNA上克隆转运蛋白基因AraT，利用BamH I和SalI两酶切位点构建酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3-araT，如图3所示；(3)菌株构建质粒pJFE3-araT用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2%葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选正确转化子；(4)菌株培养将步骤( 中验证正确的转化子单菌落用添加2%葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura，转接40ml于IOOml小三角瓶中，培养1天后再转接一次，初始OD600接为0. 5，培养条件均为300C，200r · min—1 ；(5)完整细胞悬液制备取步骤⑷中培养10小时的菌液，离心(3000r · mirT1， 5min)去掉原培养基后用pH6. 5的50mmol/L PBS液重悬；(6)完整细胞状态下测定木糖苷酶酶活用96孔平板或EP管取适量步骤(5)中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，两者总体系为120 μ 1，随后置于30°C， 200r · mirT1摇床中孵育30分钟，离心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等体积的 0. 4mol/L的Na2CO3水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(PNP)的光吸收值。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育， 离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100 μ 1，再加入100 μ 1 的0. 4mol/L的碳酸钠水溶液终止反应，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定光吸收值；根据 PH6. 5的PBS液配制的pNP标准曲线y(QD4(15nm) = 0. 0916x(pNP/nmol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6cictam值和细胞干重的对应关系y(mgdw/ml) = 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到完整细胞状态下的木糖苷酶酶活，见图4;实施例5 菌株BSW2ABP和BSW2ABT的pNPX和木糖的竞争关系测定方法如下(1)选用实施例4步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r · min^,5min)去掉原培养基后用PH6. 5的50mmol/L PBS液重悬；(2)竞争关系验证用96孔平板或EP管取适量步骤(1)中的完整细胞悬液，力口入终浓度为6mmol/L的pNPX，另外加入终浓度分别为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、 200mmol/L、250mmol/L的木糖，三者总体系为120 μ 1，随后置于30°C,200r · mirT1摇床中孵育30分钟，离心取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等体积的0. 4mol/L的Na2CO3水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP)的光吸收值。 孵育初始值测定时，先不加PNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100 μ 1，再加入100 μ 1的0. 4mol/L的碳酸钠水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定光吸收值；根据pH6. 5的PBS液配制的pNP标准曲线= 0. 0916x(pNP/nmol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6tltlnm值和细胞干重的对应关系 y(mg dw/ml) = 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到该转运蛋白对pNPX的转运速率；在两菌株中验证不同浓度的木糖对PNPX的竞争关系，证明可以用pNPX的转运速率来反映木糖的转运速率，见图8和图9。实施例6 =AraT高活性木糖转运蛋白突变体的高通量筛选通过上述实施例4的方法，本发明获得了一株高木糖转运能力的重组酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,已于2011 年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 5464。其菌学特征为该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、粘稠，呈乳白色。CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3_52， pYX242-PGKt-TEFpTPIp-xynB-PGKt, pJFE3_AraT。该菌株表达了克隆自植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)的糖转运蛋白基因AraT，其木糖转运能力较普通酿酒酵母菌株提高了一倍以上(1. 06倍，见图8)。可以预见，该菌株在利用含木糖原料生产其他产品领域中具有广阔的用途，如以该菌株为出发菌株，引入木糖代谢途径，可以构建具有高水平利用木糖能力的重组菌株。高通量筛选方法如下(1)菌种选择选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)的实验室菌株 BSW2AB(CEN. PK102-3A derivative, MATa, leu2_3，ura3-52, pYX242_PGKt_TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受体株菌；(2)表达载体构建用上下游引物 AraTup 5，-CGCGGATCCATGAATAAGCAGAAAA AGGTTT-3，和 AraTdown :5，-ACGCGTCGACTTAATGACTCGCTTGTTGTACG-3’,用植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)DNA上克隆的转运蛋白基因AraT为模板，采用易错PCR的方式获得AraT的突变库，利用BamH I和Ml I两酶切位点在pJFE3酿酒酵母附加体穿梭质粒上构建突变库表达载体；(3)菌株构建构建的质粒用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2%葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选转化子；(4)菌株培养将步骤(3)中生长的转化子单菌落点种在含200 μ 1培养基的96 孔平板中，每板同时点种3孔BSW2ABT未突变菌株作为对照，培养基为含2%葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura，培养1_2天(长至稳定期，保证各孔的OD6tltlnm值基本一致)后，再各孔对应转接10μ 1于190μ 1新鲜培养基中，培养IOh ；培养条件均为30°C， 200r · mirT1 ；(5)完整细胞悬液制备取步骤(4)中培养10小时的菌液，离心(3000r · min—1， 5min)去掉原培养基后用102 μ 1 ρΗ6. 5的50mmol/L PBS液重悬；(6)完整细胞状态下测定30分钟后生成的对硝基酚产生的光吸收(初筛)向步骤(5)的完整细胞测定酶液中，加入40mmol/L的pNPX 18 μ 1，随后置于30°C，200r · mirT1 摇床中孵育30分钟，离心(3000r MirT1Jmin)取上清100 μ 1加入96孔平板中，再加入等体积的0. 4mol/L的Na2CO3水溶液，混勻后，用酶标仪于OD4tl5nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(PNP)的光吸收值。筛选光吸收值比BSW2ABT未突变株高的菌株；(7)高突变株的木糖转运速率的测定(复筛)按步骤⑷和(5)制备步骤(6) 中得到的高突变株的完整细胞悬液，按照步骤(6)的方法重新测定生成的对硝基酚(pNP) 的光吸收值，并测定OD6tltlnm读值。根据PH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y(OT4(15mi)= 0. 0916x(pNP/miol)+0. 0735和实验室菌株的菌液OD6tltlnm值和细胞干重的对应关系y(mg dw/ml)= 0. 2365x(OD600nm)+0. 1149，计算得到转运蛋白对pNPX的转运速率(即利用完整细胞测得的酶活)，筛选木糖转运速率比BSW2ABT未突变株提高的菌株；(8)转接(7)中筛选得到的高活性菌株，反提质粒后，转化大肠杆菌扩培，测序，得到高活性的转运蛋白基因序列。


本发明公开了一株胞内表达β-木糖苷酶的酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2AB，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5465。该菌株能够在胞内表达有活性的β-木糖苷酶。本发明还提供了一种筛选能表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法，该方法用于筛选转运蛋白的反应底物是木糖结构类似物——对硝基苯-β-D-木糖苷。本发明还提供了一种通过该方法获得的一株高木糖转运能力的重组酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2ABT，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5464。