专利名称：一种转化甘油制备二羟基丙酮的方法二羟基丙酮，简称DHA，是一种最简单的多羟基酮糖，分子式为C3H2O3,作为一种重要的化工精细原料广泛地应用于医药、农药、涂料、染料颜料、香精香料、食品添加剂、饲料添加剂、日用化学品、高分子单体及聚合物、化工助剂、有机化工原料等行业，其中广泛应用于化妆品中，它可与皮肤表层自由氨基酸结合，在皮肤表面形成一层细密的薄膜，反射太阳光，屏蔽紫外线，阻止水份过度蒸发，起到很好的保湿和防晒作用。目前，二羟基丙酮的合成方法主要有三种，即化学合成法、酶法和发酵法。其中，微生物发酵法制备二羟基丙酮具有原料来源广泛、生产成本低、产品纯度高等优点，是生产二羟基丙酮的主要方法，在全球二羟基丙酮生产中，仅有10 %是由化学合成法生产的，其余90 %都是由发酵法生产。新世纪，石油供需矛盾日益尖锐，石油化工及石化燃料燃烧造成的环境问题日益突出，开发新的对环境无害的可再生能源日益得到各国的重视。生物柴油是一种环境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年来，生物柴油产业异军突起，飞速发展，而废甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物，每生产1吨生物柴油会副产0. 1吨废甘油。随着世界范围内生物柴油需求量和生产量的迅猛增长，废甘油成为丰富而廉价的原料，对它的有效利用也成为紧迫的课题。基于这一现状，本发明开发了利用微生物转化废甘油制备二羟基丙酮的技术。目前，以甘油为原料制备二羟基丙酮主要有两种方法1.化学法转化甘油制备二羟基丙酮中国专利2008100616M公开一种化学法转化甘油制备二羟基丙酮的方法，其特点是以甘油为原料，在反应温度为45 90°C、反应时间为1 30h。该方法需要使用碳负载金属作为催化剂，生产成本较高，另外反应过程中需要大量使用试剂，会对环境造成污染。2.微生物发酵甘油制备二羟基丙酮中国专利201010271671公开一种微生物发酵甘油制备二羟基丙酮的方法，该方法所使用的菌种为氧化葡萄糖酸杆菌，该菌株存在细胞密度低，培养条件高，发酵时间长， 生产强度低的缺点。发明内容本发明的目的是提供一种转化甘油制备二羟基丙酮的新方法。
本发明的具体步骤如下
将嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l接入种子培养基中培养，然后把种子液加入含甘油的发酵培养基中，进行好氧发酵，流加NaOH溶液，发酵后得二羟基丙酮。
所述菌种为嗜盐黄杆菌(Flavobacteriumhalmsphilum) ch20-l,已于 2011 年 08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该保藏中心登记入册编号为CGMCC No.5207。
所述种子培养基为陈海水1000ml，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HP042g,山梨醇5g， ρΗ6· 0,0. IMpa 灭菌 20min。
所述接入含有甘油的种子培养基中培养的温度可为25 40°C，培养的时间可为 16h ；所述含甘油的发酵培养基中的甘油的浓度可为IL发酵培养基中含有50 150g甘油； 所述发酵培养基的组成(g/L)可为蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，废甘油50 150，MgS04*7H20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa灭菌20min ；所述进行好氧发酵的条件可为30°C条件下进行好氧发酵，发酵过程中通入2 6vvm空气，搅拌转速100 400rpm，控制pH值为6 ； 所述NaOH溶液可采用2 3M的NaOH溶液。
在发酵过程中测定菌体干重浓度、甘油和二羟基丙酮浓度。
本发明所用甘油为生物柴油生产过程中的副产物甘油。
所述嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l从红树林土壤样品中筛选得到。
所述嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l 的 16S rRNA 序列如附录中序列表所示。
本发明的突出优点在于使用微生物将廉价原料废甘油转化为具有高附加值的生物基平台化合物二羟基丙酮，找到了一条有效利用废甘油的出路。此外，本发明所用菌种无生物安全性方面的隐患；同时发酵时间短，生产强度高，细菌培养条件低，降低了生产成本。


图1为二羟基丙酮的标准曲线图。在图1中，横坐标为DHA浓度(g/L)，纵坐标为吸光度；标准方程为1 = 2. 1573X-0. 008，相关系数为R2 = 0. 9989。
图2为甘油标准品的标准曲线图。在图2中，横坐标为甘油含量(g/L)，纵坐标为吸光度；标准方程为y = -0. 01914+0. 04373x，相关系数为R2 = 0. 9989。

实施例1
(1)菌种的分离和纯化
将新鲜的土壤样品Ig或水样Iml置于IOOmL富集培养基中，富集培养3 7d，取富集培养液5ml转入新的富集培养基中，依次转接3代。取富集培养液1ml，以10倍梯度连续稀释，选择合适稀释度(10_4，10_5，10_6)的菌悬液0.5ml，与分离培养基混合后倒平板。 30°C下，培养4 后，挑取单菌落。将得到的菌落转入液体发酵培养基，30°C下振荡培养30h 后，按下述方法测定发酵液中二羟基丙酮浓度
采用二苯胺显色法测定二羟丙酮(DHA)标样0.500g至IOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，即得二羟丙酮浓度为5. 00g/L的标准储备液。移取DHA标准储备液各1. 0、 2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0,10. OmL 至 IOOmL 容量瓶中，定容至刻度，即得浓度为 0. 05,0. 1、 0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 4,0. 5g/L的标准溶液，取0. 5mL标准溶液与4. 5mL 二羟基丙酮显色液在试管中混勻，置于沸水浴中反应15min，流动水冷却后于721分光光度计、620nm处测定吸光值。
利用甘油与Cu2+在碱性条件下生成深蓝色络合物，通过比色法测定甘油含量。甘油含量的适宜范围及标准曲线的绘制，当溶液中甘油含量超过10g/L时，吸光度与甘油含量不再呈线性关系，故待测溶液中甘油含量不宜超过10g/L，将甘油含量在2. 5 10g/L的各点作标准曲线。
检测结果如图1和2所示，二羟基丙酮的标准曲线为y = 2. 1573X-0. 008，R2 = 0. 9989 ；甘油的标准曲线为 y = 0. 04373χ_0· 01914，R2 = 0. 9989。
最终获得一株可以转化甘油高产二羟基丙酮的菌株ch20_l。
菌种的分离和纯化过程中所用培养基组成如下
土壤富集培养基(g/L)陈海水1000 (ml)，酵母膏5，蛋白胨5，0. IMpa灭菌20min。
分离培养基(g/L)陈海水1000 (ml)，酵母膏5，K2HP042,废甘油50， MgSO4 · 7Η200· 2，MnSO4 · H2O 0. 3，琼脂粉 20，pH 6. 0,0. IMPa 灭菌 20min。
所述发酵培养基(g/L):蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042,废甘油50-150， MgSO4 · 7Η200· 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa 灭菌 20min。
(2)菌种的鉴定
将上述步骤(1)筛选得到的菌株ch20_l进行形态特征和16S rRNA序列鉴定，具体过程如下
菌株ch20_l为革兰氏阴性杆菌，短链或成排排列，无芽孢，无鞭毛，无荚膜；其单菌落为圆形、直径约1 2mm、淡黄色、低凸起、边缘整齐、半透明状的光滑型菌落。
菌种ch20_l 的 16S rRNA 序列，其与黄杆菌 Flavobacterium sp. WB2. 4-28 的同源性最高，可达99. 867% ο
对菌株ch20_l进行常规的生理生化鉴定试验，其结果基本与伯杰细菌鉴定手册中黄杆菌属中的嗜盐黄杆菌特征相同，命名为Flavobacterium halmsphilum ch20_l。
基于以上特征，将上述步骤(1)筛选得到的菌株ch20_l鉴定为嗜盐黄杆菌 (Flavobacterium halmsphilum)ch20_l。
实施例2
(1)发酵方式250ml三角瓶，摇床发酵。
(2)菌种嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halmsphilum) ch20_l。
(3)培养基
种子培养基(g/L)陈海水1000(ml)，蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMPa 灭菌 20min。
发酵培养基(g/L)陈海水1000(ml)，蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，废甘油90， MgSO4 · 7H20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMPa 灭菌 20min。
(4)发酵过程
种子培养将嗜盐黄杆菌接到种子培养基中O50ml三角瓶，装液量50ml)，30°C下培养16h。
发酵培养将种子液按5%接种量转接到含90g/l废甘油的发酵培养基O50ml三角瓶，装液量50ml)中，在30°C下培养30h。
(5)发酵结果
发酵结束时，发酵液中二羟基丙酮浓度60. 3g/L，生产强度2. 01g/L · h。
实施例3
(1)发酵方式5L机械搅拌发酵罐，通空气分批发酵
(2)菌种同实施例2
(3)培养基
种子培养基(g/L)陈海水1000(ml)，蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMPa 灭菌 20min。
发酵培养基(g/L)陈海水1000(ml)，蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，废甘油90， MgSO4 · 7Η20 0. 2，MnSO4 · H2O 0. 3，pH 6. 0,0. IMpa 灭菌 20min。
(4)发酵过程
种子培养同实施例2
发酵培养使用5L发酵罐，装液量2L，发酵温度控制在30°C，pH用浓度为3mol/L NaOH溶液自动调节维持在6. 0，将种子液按5%接种量转接到含90g/l废甘油的发酵培养基，搅拌转速200rpm，通入空气量为6vvm，发酵时间为Mh。
(5)发酵结果
发酵结束时，二羟基丙酮浓度达到70. 2g/L，生产强度为2. 93g/L · h。
实施例4
(1)发酵方式500ml三角瓶，全细胞转化。
(2)菌种同实施例2。
(3)培养基
种子培养基(g/L)陈海水1000(ml)，蛋白胨5，酵母膏5，K2HP042，山梨醇5， pH6. 0,0. IMpa 灭菌 20min。
全细胞培养基(g/L)废甘油(甘油含量约96% w/w)70，pH 6. O,MgSO4 ·7Η20 0. 2， (NH4)HPO4L 0，MnSO4 · H2O 0. 3。
(4)转化过程
种子培养同实施例2
转化过程生长培养16 20h的细胞于6000r/min离心30min，无菌水洗涤2 3 次，用含6%甘油和0.2% WK2HPO4的无菌水溶液洗涤2次，在同样的溶液中制成悬浮液0 4°C保存。转接至装有IOOmL静止细胞培养液的500mL三角瓶中，摇床上30°C转化25h。
(5)转化结果
发酵结束时，发酵液中二羟基丙酮浓度达到60. 2g/L，生产强度达到2. 50g/L · h。

一种转化甘油制备二羟基丙酮的方法，涉及一种多羟基酮糖。将嗜盐黄杆菌(Flavobacterium halmsphilum)ch20-1接入种子培养基中培养，然后把种子液加入含甘油的发酵培养基中，进行好氧发酵，流加NaOH溶液，发酵后得二羟基丙酮。使用微生物将廉价原料废甘油转化为具有高附加值的生物基平台化合物二羟基丙酮，找到了一条有效利用废甘油的出路。所用菌种无生物安全性方面的隐患；同时发酵时间短，生产强度高，细菌培养条件低，降低了生产成本。