专利名称：冬虫夏草中国被毛孢合成代谢黄嘌呤的酶、基因及其应用的制作方法冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus a rmoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是ー类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推祟。中医认为，冬虫夏草入肺肾ニ经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的ー种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是ー种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生冬虫夏草代用品研究多集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。虫草发酵生产虫草替代品，既可有效保护虫草这ー珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于エ业化大規模生产。生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似，因而国内外一直致カ于虫草菌丝体的发酵培养。人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药理、植化研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺，通过对发酵条件的优化，菌丝体生物量和代谢产物的量均有明显提尚。近年来，随着天然产物化学和现代色谱技术的飞速发展，在对虫草产品研发中已逐步由虫草原料或粗提物的直接利用转向更深层次的功能性代谢产物研究。国内外已对虫草代谢产物做了大量的研究，代谢产物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等几大类化合物，其中嘌呤类核苷、虫草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代谢产物在生物合成、药理作用等方面的研究初见成效。核苷类是虫草最主要的活性物质之一，其中嘌呤类核苷包括腺苷和鸟苷及它们的前体类物质次黄嘌呤核苷(肌苷)和黄嘌呤核苷等。研究表明腺苷可作为心脏病治疗药物，还可用于诊断冠心病，其类似物具有抗病毒活性和抗肿瘤作用；肌苷可用于心脏病、肝病、白血球減少症、血小板減少症、视神经萎縮和中心性视网膜炎等疾病的治疗，能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；鸟苷则可作为三氮唑核苷、无环鸟苷等许多抗病毒药物的合成原料。由于嘌呤核苷及其类似物的重要生理作用，国内外有关微生物生产嘌呤类核苷已有很多石开Matsui 等(Matsui, Sato et al. Mutation of an inosine-producingstrain of Bacillus subtilis to DL—metnionine sulfoxide resistance for guanosineproduction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997, 34(4):337-341.)对肌苷生产菌B. subtilisl411进行诱变处理得到鸟苷高产菌AG169。为了进一步提高生产水平，国内有研究人员对生产菌中嘌呤核苷合成途径的遗传 背景进行了研究(Qian，Caiet al. Analysis of three nucieotiae sequences involved m purine nucieotiaesbiosynthesis in inosine and guanosine-producing bacilus subtilis.ActaMicrobiologica Sinica, 2003,43(2) :200-205.)。该研究从分子水平掲示了生产菌的部分遗传特性，有助于在基因水平理解产物在生产菌中的积累。目前，所应用的嘌呤类核苷生产菌以枯草芽孢杆菌为主，而作为重要合成代谢嘌呤类核苷的冬虫夏草菌，还只停留在代谢产物成分分析和功效的研究上，对冬虫夏草菌嘌呤类核苷合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很少见。
本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢黄嘌呤的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢參与鸟嘌呤出发合成代谢黄嘌呤的酶、编码基因及其应用。本发明采用的技术方案是ー个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢參与鸟嘌呤出发合成代谢黄嘌呤的鸟嘌呤脱氨酶序列为SEQ ID No. I的punGl蛋白和序列为SEQ ID No. 2的punG2蛋白；该酶可催化鸟嘌呤制备黄嘌呤。由鸟嘌呤合成代谢获得黄嘌呤的路径如下本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与鸟嘌呤出发合成代谢黄嘌呤的鸟嘌呤脱氨酶，编码这个酶的基因及其应用。所述鸟嘌呤脱氨酶，包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的蛋白，其编码基因分别对应为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明从原理上对鸟嘌呤合成黄嘌呤的代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节黄嘌呤生物合成基因的表达，赋予宿主黄嘌呤的高表达性，为扩大黄嘌呤的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。