专利名称：治疗白血病的靶向磁性纳米药物的制备方法 恶性肿瘤是当今世界最主要的死亡原因之一。虽然化学药物治疗经历了半个多世纪的发展和完善，成为恶性肿瘤综合治疗的主要手段之一，但抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了正常的组织细胞，所以在临床应用时常引起严重的毒副反应。因此寻求既能保护正常组织器官又具有最大可能杀伤肿瘤细胞的治疗途径和方法，已成为当今广大医药工作者研究的热门课题。白血病是造血系统恶性疾病，系发育过程中分化成熟障碍的造血细胞在骨髓等组织克隆性异常增生，并浸润其他组织和脏器，使正常造血受到抑制，由此产生贫血、出血、感染、肝脾淋巴结肿大等一系列症状体征。白血病是导致恶性肿瘤死亡的主要疾病之一，其中急性白血病占35岁以下成人肿瘤死亡首位。临床主要用于治疗白血病的常用抗肿瘤药包括正定霉素和阿霉素等，其中，正定霉素(柔红霉素)为抗瘤谱较广的抗肿瘤药，能嵌入DNA双螺旋中与DNA结合，使其模板发生改变，抑制DNA和RNA聚合酶，阻止DNA和RNA的合成，为细胞周期非特异性药物；而阿霉素(羟基红比霉素)可与肿瘤细胞DNA交联，抑制DNA复制，并阻断RNA聚合酶的作用，抑制RNA的合成。由于白血病的发病原因目前还没有一个科学的解释，因此目前的治疗原则为综合治疗，联合化疗是目前临床上治疗白血病最常用和最有效的手段之一，例如对急性白血病采用强烈诱导，早期强化，药物剂量递增，骨髓抑制性维持治疗方法。由于人体正常细胞和肿瘤细胞在生物化学方面的差异很小，大多数抗肿瘤药物对肿瘤细胞和正常细胞都有非选择性的杀伤作用，常引起严重的系统性毒副作用，而且会被很快地从系统循环中清除掉，在肿瘤局部达不到有效的治疗浓度，在肿瘤部位滞留的时间也较短，从而降低了化疗药物的治疗疗效。所以当前的疗效还不够满意，药物治疗只是改善患者的一般症状，缩小肝脾、降低白细胞数，但不能阻止急变的出现，所以不能达到全面根治的治疗效果。为了解决这些问题，人们开始了对药物载体的研究，以期使药物指向机体的特定部位，并以被动形式释放药物。目前常用的载体有脂质体、红细胞外壳、大分子聚合物及传统的微球等。自70年代研究人员提出磁控靶向药物传递系统的概念以来，磁性物质载体的研究一直是当前药物新型制剂最活跃的领域之一，它是将药物微球中加入了具有磁响应性的物质，将磁性药物注入组织内，在肿瘤外部施加有效强度和梯度的外磁场，利用磁性药物的流动性能和磁场诱导性能，将磁性药物载体固定于肿瘤靶区内。由于单分散的磁性纳米药物载体的制备一直是一个技术瓶颈问题，目前尚未见利用磁性纳米粒子作为药物载体直接作用于靶细胞中的报道。
技术问题本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种白血病靶向磁性纳米药物的制备方法，它具有白血病细胞靶向性，由于该纳米粒较多的含有Fe3O4磁性纳米药物，而且由于微量Fe3O4磁性纳米粒子在生物体内广泛存在，因此微量Fe3O4磁性纳米粒子对生物体无毒无害，与阿霉素和柔红霉素等抗癌药物协同作用，可显著提高白血病细胞中药物浓度，克服靶向细胞的耐药性，增强抗癌药物的抑瘤效果和靶向杀伤作用。技术方案，本发明提供了表面功能化的单分散Fe3O4磁性纳米药物载体的制备方法，即以表面功能化的单分散磁性纳米粒子Ni，或Fe2O3，或Fe3O4为载体，在载体表面载有阿霉素，或柔红霉素，或其它治疗白血病的药物。所述的其它治疗白血病的药物是抗菌素(如表阿霉素，平阳霉素)、中草药(如泰素(紫杉醇))。表面功能化的单分散磁性纳米粒子的粒径范围为30nm～50nm。单分散磁性纳米粒子Ni，或Fe2O3，或Fe3O4是在电化学氧化条件下用电沉积方法制备的；其电解过程在0.1M TBA-Br-2(tetrabutylammonium-bromide(TBA-Br)2-propanol)丙醇溶液中进行，其中用高纯的Ni或Fe片作阳极，用玻碳做阴极，沉积磁性纳米团簇覆盖在TBA上。沉积磁性纳米团簇采用热液方法进一步改进，即沉积以后在有机溶液或水中进行热处理，然后将团簇粉末在100-250℃加热退火，从而得到表面功能化的单分散磁性纳米药物载体。单分散的磁性纳米粒子表面带有正电荷和疏水性功能团。本发明的白血病靶向磁性纳米药物用作治疗药物时，其中所述的单分散磁性纳米粒子与阿霉素，或柔红霉素，或其它治疗白血病的药物的重量比为1∶2～1∶5。
本发明的白血病靶向磁性纳米药物可以制成静脉注射的冻干粉制剂。实验表明，该药物在细胞中的分布率达到80％～95％。该靶向磁性纳米药物在无外加磁场情况下，具有天然的白血病细胞靶向功能；在外加磁场的情况下辅助治疗，能显著加大肿瘤区域的白血病细胞内药物浓度，减小由于细胞耐药性带来的危害，并且其靶向性有助于降低药物的全身毒性作用，从而达到控制与有效杀伤癌细胞的作用，而对正常细胞无影响，因此对于白血病的靶向治疗具有重要应用前景。
总之，本发明具有新的药效，开发成本低，靶向用药准确，对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。
我们研究和制备了白血病的靶向Fe3O4磁性纳米药物，探讨了表面功能化Fe3O4磁性纳米药物载体在与不同化疗药物联合作用增强抗癌药物的抑瘤效果和有效杀伤白血病细胞的途径。
由于纳米粒子处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，是一种典型的介观系统，因而它具有表面效应、小尺寸效应和量子隧道效应等许多奇特性质。相关研究发现某些磁性纳米药物子对于生物具有重要性，在某些生物体内，如趋磁细菌、蜜蜂、鸽子等体内，含有微量的Fe3O4，这些物质使得这些生物体对于磁场有特定的感应性。Fe3O4在生物体内的天然存在同时也说明了这些纳米粒子微量存在于生物体内时对于生物体本身并没有危害，因此我们选择使用Fe3O4磁性纳米粒子作为药物的载体也可减少药物对生物体的损害。
有益效果我们药物靶向实验研究表明，通过使用磁性纳米载体载有的药物固定于肿瘤组织细胞内，使靶向药物在靶细胞中以控释的方式从载体中释放出来，可以有效地提高靶细胞中的药物浓度，减小由于细胞耐药性带来的危害，延长药物在靶区细胞中的作用时间，使药物在靶组织的细胞或亚细胞水平发挥药效作用，而对正常组织细胞无太大影响。

本发明的治疗白血病的靶向磁性纳米药物的制备方法以表面功能化的单分散磁性纳米粒子Ni，或Fe2O3，或Fe3O4为载体，在载体表面载有阿霉素，或柔红霉素，或其它治疗白血病的药物；其中所述的单分散磁性纳米粒子与阿霉素，或柔红霉素，或其它治疗白血病的药物的重量比为1∶2～1∶5。所述的其它治疗白血病的药物是抗菌素(如表阿霉素，平阳霉素)、中草药(如泰素(紫杉醇))。
(1)单分散表面功能化Ni，或Fe2O3，或Fe3O4纳米粒子的制备在电化学氧化条件下，用电沉积方法制备单分散Ni，或Fe2O3，或Fe3O4的纳米粒子。电解过程在TBA-Br-2丙醇溶液中进行，其中用高纯的Ni或Fe片作为阳极，用玻碳电极作为阴极。电解过程在室温下进行，沉积团簇覆盖在TBA上。沉积过程中，采用热液方法来合成单分散纳米结构。热液处理在有机溶剂或水中进行。Fe3O4纳米粒子可以通过使沉积的粉末在100-250℃下退火得到。表面功能化的单分散磁性纳米粒子的粒径范围为30nm～50nm。
在制得了单分散Fe3O4磁性纳米药物载体后，将该磁性纳米粒溶于药物溶液中，由于Fe3O4磁性纳米粒表面带有正电荷和疏水基团，因此可以表面负载柔红霉素或阿霉素或其它治疗白血病的药物，如抗菌素(表阿霉素，平阳霉素)、中草药(如泰素(紫杉醇))等药物进入靶向肿瘤细胞。
我们将含有Fe3O4磁性纳米粒的柔红霉素或阿霉素加入靶向细胞溶液中，并与未加入Fe3O4纳米粒的药物作用进行了对比实验。激光共聚焦荧光显微镜的观察结果表明，磁性纳米粒Fe3O4与柔红霉素或阿霉素联合作用能够显著提高敏感细胞和耐药细胞中药物浓度，促进肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无太大影响。
(2)对作用细胞的实验研究A对K562敏感细胞作用的共聚焦荧光显微镜研究①在K562敏感细胞中加入抗癌药物阿霉素15分钟后的单个K562细胞的共聚焦荧光图像，从中可以看出药物分子在细胞膜表面聚集，因此荧光主要集中于细胞膜表面和细胞核内的部分区域；②K562敏感细胞与加入阿霉素靶向磁性纳米药物15分钟后的单个K562细胞的共聚焦荧光图像。可以看出，药物在K562敏感细胞内大量聚集成块，主要的集中于细胞核内，说明Fe3O4磁性纳米粒的存在导致了药物分子高浓度的进入K562肿瘤细胞内，并集中分布于细胞核内，表明Fe3O4磁性纳米粒与阿霉素药物的联合作用，有效地提高了K562细胞中药物的浓度，增强了药物对细胞的靶向作用，从而更加有助于药效的发挥。
B对K562耐药细胞作用的共聚焦荧光显微镜研究①K562耐药细胞与加入阿霉素作用15分钟后的单个细胞共聚焦荧光图像，从中可以看出由于细胞对药物有一定的抗药性，导致细胞对药物吸收较慢，药物在细胞膜表面聚集，因此荧光主要集中于细胞膜表面和细胞核内的部分区域；K562耐药细胞与加入阿霉素靶向磁性纳米药物15分钟后的单细胞共聚焦荧光图像。可以看出，药物在耐药细胞内聚集，且有许多颗粒状亮点出现，主要的集中于细胞核内，表明Fe3O4纳米粒与阿霉素药物分子联合作用，帮助药物分子克服细胞的耐药性进入细胞，有效地提高了K562耐药细胞中药物的浓度，促使细胞进一步凋亡，增强了药物分子对细胞的靶向杀伤作用，从而更加有助于药效的发挥。
与此同时，磁性纳米药物与抗癌药物柔红霉素联合作用也有效地提高了细胞内药物浓度，对肿瘤细胞(如K562敏感细胞和耐药细胞)的靶向杀伤作用明显增强。
我们经过实验研究，开发了以磁性纳米颗粒为载体的阿霉素和柔红霉素的抗白血病药物，对细胞和动物的实验表明，含有磁性纳米粒的药物比没有磁性纳米颗粒时的药效显著增强，因此，这种技术可望用于临床对恶性肿瘤的有目的靶向治疗。本发明将大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物的现代化具有重要的价值。


治疗白血病的磁性纳米药物的制备方法涉及生化医药技术，该制备方法以表面功能化的单分散磁性纳米粒子Ni，或Fe