一种治疗老年痴呆症的中药有效部位及其制备方法与应用的制作方法【技术领域】，涉及一种治疗老年痴呆症的中药有效部位及其制备方法与应用，具体涉及抑肝散的有效部位及其制备方法与应用。[0002]老年性痴呆又叫阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。[0003]据不完全统计，到2025年，世界范围内老年性痴呆的患病人口将达到220万。在我国，老年痴呆多发生于65岁以上老人，发病率为4% -5%,75岁和85岁以上的发病率分别为10%和20%，提示老年人年龄每增加10岁，痴呆的患病率增加I倍。[0004]西药治疗AD以抗精神失常药为主，但由于AD发病机制复杂，涉及多种信号通路，单靶向的药物虽能在一定程度上改善或缓解患者的症状，但无法达到较好的治疗效果。中药具有多成分、多靶点、多途径调节的特点，在治疗这种慢性疾病方面具有显著优势，且药性较西药和缓，不 良反应小，并能缓解西药无效的症状。[0005]传统中医药理论认为，肝主疏泄，能够调畅情志，如果肝气疏泄失常，气机不调，气血不和，则可引起情志的异常变化。其中肝阳亢奋时，会出现眩晕、头痛、易怒、不寐、失神、四肢震颤、言语障碍、行走困难、健忘等症状。[0006]抑肝散出自明代薛凯所著的《保婴撮要》，该方由钩藤、柴胡、当归、川芎、苍术、茯苓和甘草等七味药按照3:2:3:3:4:4:1.5的比例组成，主治小儿肝火亢进所致的虚热发搐，痰热咬牙，惊悸寒热，呕吐痰涎，腹胀少食，睡卧不安。[0007]抑肝散是治疗肝阳亢奋的有效药物，具有健脾养血平肝解痉之功。钩藤清热平肝，熄风止痉；柴胡疏肝解郁，和解清热；肝气有余则肝血不足，故用当归养血柔肝；川芎活血行气；肝木为病，易剋犯脾土，故应实土而防木侮，故用茯苓、苍术、甘草培补脾土，淡渗利湿；甘草并有缓急并助钩藤止痉之功。七味合用，则肝血得养，脾土得补，肝气得疏，并能熄风镇痉，则诸症悉愈。
[0008]研究表明，抑肝散对老年痴呆病的行为和心理学症状(Behavioral andpsycho logical symptoms of dementia, BPSD)具有明显的治疗效果，在中国和日本应用广泛，临床用于治疗失眠症、血管性痴呆，阿尔兹海默症和帕金森症等。


[0009]本发明的目的在于提供一种治疗老年痴呆症的中药有效部位。
[0010]本发明的另一个目的在于提供治疗老年痴呆症的中药有效部位的制备方法。
[0011]本发明的另一个目的还在于提供治疗老年痴呆症的中药有效部位在制备抗老年痴呆症药物中的应用。
[0012]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0013]一种治疗老年痴呆症的中药有效部位，它是由以下方法制得的:
[0014](I)取钩藤6份、柴胡4份、当归6份、川弯6份、苍术8份、茯苓8份、甘草3份，加入总药材重量5-15倍量的醇水或水回流提取2~4次，每次提取1.5~4小时，合并提取液，浓缩至无醇味，得到浓缩液；
[0015](2)取步骤(1)得到的浓缩液上大孔树脂柱，用乙醇浓度O~95%的乙醇-水系统梯度洗脱，每个梯度的洗脱体积为柱体积的6-10倍，收集浓度为30%~50%的乙醇洗脱液，回收溶剂，得到中药有效部位。
[0016]本发明所述的治疗老年痴呆症的中药有效部位，由阿魏酸、甘草苷、洋川芎内酯1、异甘草苷、异去氢钩藤碱、甘草酸和柴胡皂苷B2等单体化合物组成，具体包含有重量百分比2% -10%的阿魏酸、20% -50%的甘草苷、3% -15%的洋川芎内酯1、5% -20%的异甘草苷、0.1 % -5%的异去氢钩藤、I % -10%的甘草酸、0.1 % -5%的柴胡阜苷B2。优选的,所述的中药有效部位包含有重量百分比3 % -6 %的阿魏酸、30 % -40 %的甘草苷、5 % -10 %的洋川芎内酯18^-15%的异甘草苷、1^-2%的异去氢钩藤、3%-5%的甘草酸、0.1%-0.5%的柴胡皂苷B2。
[0017]本发明所述的治疗老年痴呆症的中药有效部位的制备方法，包括以下步骤:
[0018](I)取钩藤6份、柴胡4份、当归6份、川弯6份、苍术8份、茯苓8份、甘草3份，加入总药材重量5-15倍量的醇水或水回流提取2~4次，每次提取1.5~4小时，合并提取液，浓缩至无醇味，得到浓缩液；
[0019](2)取步骤(1)得到的浓缩液上大孔树脂柱，用乙醇浓度O~95%的乙醇-水系统梯度洗脱，每个梯度的洗脱体积为柱体积的6-10倍，收集浓度为30%~50%的乙醇洗脱液，回收溶剂，得到中药有效部位。
[0020]制备方法可以采用以下优选的技术方案，步骤(1)中，先加入总药材重量5-15倍量的乙醇浓度50%~70%醇水回流提取I~3次，每次提取1.5~4小时，再加入总药材重量5-15倍量的水回流提取I次，每次提取1.5~4小时；合并提取液，浓缩至无醇味，得到浓缩液；步骤(2)中，浓缩液上大孔树脂柱，用体积为柱体积6-10倍的水、40%乙醇、80%乙醇和95%乙醇洗脱，收集40%的乙醇洗脱液，回收溶剂，得到中药有效部位。所述的大孔树脂柱的填料为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。
[0021]神经系统的许多疾病，如血管性痴呆、阿尔茨海默病、癫痫、及帕金森症等的发生和发展均与谷氨酸的神经兴奋毒性有密切关系。经药理实验表明，本发明有效部位对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型有保护作用，且效果明显优于抑肝散总提取物。
[0022]本发明所述的治疗老年痴呆症的中药有效部位在制备治疗老年痴呆症药物中的应用。
[0023]所述的中药有效部位和药学上可接受的载体制成药学上认可的任何一种剂型，所述的剂型包括软胶囊、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂。
[0024]常用载体可选用，崩解剂如:羟丙基淀粉、羟丙基纤维素、羧甲基淀粉纳、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素纳等；填充剂如:乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如:乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如:滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000 ;润湿剂如:十二烷基硫酸钠、吐温80。
[0025]与现有技术比较本发明的有益效果:
[0026]本发明利用一定的分离手段，从中药复方抑肝散中分离出了有效部位，并采用现代药理实验方法，证明该有效部位的神经保护作用明显优于原方，可用于制备抗老年痴呆症的药物。
[0027]本发明首次研究了抑肝散复方的有效部位，30 %~50 %的乙醇有效部位对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤模型有保护作用，且效果明显优于抑肝散总提取物。神经系统的许多疾病，如血管性痴呆、阿尔茨海默病、癫痫、及帕金森症等的发生和发展均与谷氨酸的神经兴奋毒性有密切关系。说明本发明抑肝散复方的有效部位在制备治疗老年痴呆症药物方面具有很好的应用前景。




[0029]根据下述实施例进一步对本发明进行说明。
[0030]实施例1
[0031]一种治疗老年痴呆症的中药有效部位的制备方法，包括以下步骤:
[0032](I)取钩藤6份、柴胡4份、当归6份、川弯6份、苍术8份、茯苓8份、甘草3份，加入总药材重量10倍量的70%乙醇在80°C下回流提取2h，过滤的提取液；再加入总药材重量10倍量的50%乙醇在80°C下回流提取2h，过滤的提取液；最后加入总药材重量10倍量的水在100°C下回流提取2h，过滤的提取液；合并三次提取液，浓缩至无醇味，得到浓缩液，即总提物浸膏；
[0033](2)取步骤(1)得到的浓缩液上DlOl型大孔树脂柱，依次用体积为柱体积6_10倍的水、40%乙醇、80%乙醇和95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，于80°C减压回收试剂，干燥，得到抑肝散的有效部位群，分别命名为YGS40、YGS80、YSG95。
[0034]实施例2抑肝散有效部位群在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的保护作用
[0035]I细胞株
[0036]PC12细胞(PC12cell line):大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(中国药科大学生理实验室提供)。
[0037]2药物、试剂和仪器
[0038]高糖DMEM干粉培养基:GIBC0公司，4°C保存。
[0039]小牛血清(NBCS) =GIBCO公司，规格:500mL，_20°C分装保存。
[0040]青霉素:AMRESC0公司，规格:0242_100MU，1500_1750U/mg，4°C保存。
[0041]链霉素:AMRESC0公司，规格:0382_100G，1000U/mg，室温保存。
[0042]胰蛋白酶(Trypsin 1:250):AMRESC0公司，南京博全科技有限公司分装，规格:10g，4°C 保存。
[0043]MTT:上海源叶生物科技有限公司，规格:lg，4°C保存。
[0044]谷氨酸(glutamic acid):上海源叶生物科技有限公司，规格:100g,室温保存。
[0045]DMSO (Sigma, USA)。
[0046]SW-CJ-2FD型双人单面超净化工作台:苏州净化设备有限公司。
[0047]Forma3Ill 型水套式 CO2 培养箱:Thermo Electron company。
[0048]Olympus CKX41型倒置相差显微镜。
[0049]Leica倒置突光显微镜。[0050]1810B型自动双重纯水蒸馏器(石英管加热式):上海申立玻璃仪器有限公司。
[0051]YXQ-LS-50S II型立式压力蒸汽灭菌器:上海博迅实业医疗设备厂。
[0052]TCL-16G-A型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂。
[0053]BS224型电子天平:北京塞多利斯仪器系统有限公司。
[0054]T6新世纪紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司。
[0055]Eon型酶联免疫检测仪:ΒΙ0_ΤΕΚ美国。
[0056]3试剂配制
[0057]无菌高糖DMEM培养液(含4500mg/L葡萄糖，110mg/L丙酮酸钠):高糖DMEM干粉培养基加超纯水950mL溶解，加入青霉素0.06g、链霉素0.lg, NaHCO3L 5g，调pH7.0-7.2。用直径0.22 μ m 一次性微孔滤器抽滤除菌，分装，4°C保存。
[0058]10%小牛血清高糖DMEM培养液:将NBCS加入配制好的无菌高糖DMEM培养液，使其体积分数为10%，4°C保存。
[0059]D-Hankj s 缓冲盐溶液:KC10.4g、Na2HPO4.12Η200.134g、NaC18.0g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，依次完全溶解于IL超纯水，高压灭菌，分装，4°C保存。
[0060]0.125%胰蛋白酶溶液:称取胰蛋白酶0.125g，溶解于IOOmL D-HankJ s缓冲盐溶液中，用直径0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0061]MTT溶液:精密称取ΜΤΤ0.05g，加入IOmL D_Hank’s缓冲盐溶液，加热超声助溶，充分溶解后，用直径0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，浓度为5mg/mL，4°C避光保存，两周内使用。
[0062]谷氨酸溶液:称取谷氨酸适量，加超纯水溶解，制成15mM/L的谷氨酸溶液。
[0063]4样品溶液配制:
[0064]总提物溶液配制:称取总提物浸膏适量，加超纯水超声溶解，制成1000 μ g/mL的总提物储备液，依次稀释成 700 μ g/mL、500 μ g/mL、300 μ g/mL、100 μ g/mL>50 μ g/mL 的总提物溶液。
[0065]YSG40:称取YSG40适量，加超纯水超声溶解，制成1000 μ g/mL的YSG40储备液，依次稀释成 700 μ g/mL、500 μ g/mL、300 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL 的 YSG40 溶液。
[0066]YGS80:称取YSG80适量，加超纯水超声溶解，制成1000 μ g/mL的YSG80储备液，依次稀释成 700 μ g/mL、500 μ g/mL、300 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL 的 YSG80 溶液。
[0067]YGS95:称取YSG95适量，加超纯水超声溶解，制成1000 μ g/mL的YSG95储备液，依次稀释成 700 μ g/mL、500 μ g/mL、300 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL 的 YSG95 溶液。
[0068]5 方法
[0069]5.1PC12细胞的培养[0070]复苏后的PC12细胞接种于75cm2培养瓶中进行培养。培养液为10%小牛血清高糖DMEM培养液，37°C,5% CO2条件下的CO2培养箱培养。隔日换液一次，待细胞在瓶底单层铺满约80%后即可用以实验，倾去培养液，用少许D-Hank’ s缓冲盐溶液荡洗两次，加入适量的0.125%胰蛋白酶溶液进行消化，在倒置相差显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，小心将消化液倒弃，立即加入适量10%小牛血清高糖DMEM培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打数次，使细胞分散成单细胞悬液，根据实验需要调整细胞密度，接种于培养瓶中供实验时使用。
[0071]5.2细胞造模及MTT步骤:
[0072]5.2.1细胞分组
[0073]将96孔细胞培养板除掉四周的孔外，其余各孔按照列分组，依次设为调零组、正常对照组Glu (-)、模型对照组Glu (+)、给药组，每个给药组6个浓度，每个给药浓度设置6个复孔。
[0074]5.2.2 接种
[0075]选取对数生长期的PC12细胞，按照每孔5000个细胞接种于96孔板中，调零组(只含10%小牛血清高糖DMEM培养液)除外，每孔加入含细胞的培养液200 μ I。正常对照组只加入细胞，不给药物。细胞接种后培养24h，使贴壁。
[0076]5.2.3造模及给药 [0077]弃去上清培养液，给药组加入不同浓度的抑肝散总提取物及各有效部位溶液，置于37度，CO2培养箱培养24h后，给药组和模型对照组加入终浓度为15mM/L的谷氨酸溶液培养24h。
[0078]5.2.4测定步骤
[0079]在作用结束前4h，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ 1，继续培养4h，然后终止培养，小心弃去上清液，每孔加入DMS0150 μ 1，水平震荡lOmin，使蓝紫色沉淀充分溶解，酶联免疫检测仪490nm波长处读取各孔吸光度值，取平均值。正常对照组细胞的吸光度的平均值作为标准(100% )，其它各孔的吸光度值和对照组的均值的比值表示各组细胞的相对存活率。
[0080]6实验结果
[0081]通过考察不同浓度的抑肝散总提物和各有效部位溶液对抗谷氨酸诱导PC12细胞损伤的作用，实验结果见表1和图1，抑肝散总提物和各有效部位在50-1000 μ g/mL浓度范围内，均可不同程度地抑制谷氨酸对PC12神经细胞的损伤，提高细胞存活比例，且YGS40对神经细胞的保护作用明显优于总提物溶液和YGS80、YGS95溶液。
[0082]表1不同浓度抑肝散总提物及各有效部位抗谷氨酸诱导PC12细胞损伤实验结果