木质纤维素生物质的快速且低成本的酶促完全转化的制作方法[0002]木质纤维素生物质提供有前景的石油替代物，提供可再生且〃碳中和(carbonneutral)"的燃料如生物乙醇和其它传统石油基产品如塑料的来源。木质纤维素生物质可被酶促水解，以提供随后用于各种生物合成工艺的可发酵碳水化合物。[0003]由于其复杂的化学结构，通常只有在一些使得纤维素纤维易于被酶催化的预处理后，木质纤维素才能通过目前已知的酶活性来有效地水解。此类预处理工艺通常包括加热至较高温度(100至250°C)。降低成本或以其他方式增加生产规模的商业可行性的生物质预处理和加工方法已引起强烈的兴趣。[0004]严重影响木质纤维素生物质加工的总成本的一个因素是纤维素酶的成本。因此，更有效地利用纤维素酶或改进可发酵碳水化合物的总产率的预处理木质纤维素生物质的酶促水解方法是有利的。[0005]已受到相当大关注的一类改进是用于回收酶或以其他方式降低酶消耗的策略。[0006]之前关于纤维素酶回收的研究表明回收主要取决于两个因素-α)水解程度和(ii)使用的原料的木质素含量。作为一般趋势，据报道，在原料水解更完全的情况下，改进回收中的酶回收。然而，由于原料变得水解更完全，这种改进的纤维素酶回收的倾向被纤维素酶对木质素的非特异性结合增加的相关倾向所抵消。不同回收策略的比较表明，原料的木质素含量是控制纤维素酶回收的唯一最重要的变量。参见参考文献I。[0007]已经提出了许多纤维素酶回收策略。在未通过化学处理脱木质素的原料中，现行的方法是在原料水解的中间程度下回收酶。首先从水解反应混合物中过滤或以其他方式回收纤维素残余物，然后与新鲜原料接触，使得以高达50-70%的水平回收纤维素酶活性。参见参考文献2和3。
[0008]在通过化学处理脱木质素的原料中，以前的研究指出，在“完全”水解后，其中没有纤维素残余物剩下，可获得最大的酶回收。参见参考文献I。然而，最近的研究表明，组合使用脱木质素的底物和表面活性剂时，最佳的纤维素酶回收要求从上清液和纤维素残余物两者中回收，即最佳的回收要求小于"完全"的原料水解程度。参见参考文献4和5。
[0009]之前开发纤维素酶回收策略的努力集中在降低酶载量。稀释酶体系通常被认为是可取的。在较高的酶载量下，任何给定原料在酶促水解反应中任何给定时间点的水解程度增加了。参见参考文献6。然而，该效果是对数性的，意味着为了获得给定时间点下转化率的较小差异要求大的酶载量差异。因此，为了优化酶促水解时间而不产生过度的酶成本，现有技术之前认为比较稀释的酶浓度是可取的。参见参考文献7。商业规模的生物乙醇生产的技术经济模型之前表明，大约10FPU/g干物质(DM)预处理生物质的纤维素酶载量是理想的，因为这被认为是在合理成本下提供合理水解时间内最高的葡萄糖产量。参见参考文献30
[0010]之前认为> 10FPU/g DM预处理生物质的纤维素酶载量在商业规模生物乙醇生产中是不可取的。在连续水解回收系统中总成本和葡萄糖产量的一个广泛的比较表明，在使用未脱木质素的原料时，20FPU/g DM的高酶载量相对于更稀释的10FPU/g DM的载量不具有优势。参见参考文献2。
[0011]我们已经发现，通过使用高的初始酶载量(至少17FPU/g DM)，然后在从之前循环中回收的纤维素酶活性的每个水解循环中补充较低剂量的酶，可进行具有整体优势的依靠SHF或SSF的商业生物乙醇生产中的纤维素酶回收。在这些高纤维素酶水平下,非特异性木质素结合似乎变得饱和。可仅使用低水平的新鲜酶补充，在多个水解循环中保持高酶剂量水平。这些高纤维素酶活性水平大大缩短水解时间，导致资本成本降低和生产规模能力增加。高纤维素酶活性水平还导致更完全的转化％，降低所生产的每升乙醇的生物质成本。使用预处理的未脱木质素的木质纤维素原料获得了有效的结果。在一些情况下，可如此大大改进水解产率和回收纤维素酶活性至如此高程度，以使与在商业酶供应商推荐的低酶水平下所获得的相比，降低每升乙醇最终的酶消耗。
[0012]发明简述
[0013]提供用于改进生物乙醇生产中木质纤维素生物质加工的方法。使热水预处理的木质纤维素生物质在高初始纤维素酶载量(至少15FPU/g DM)下进行分步水解和发酵(SHF)或预水解并进行同步糖化和发酵(SSF)。随后回收纤维素酶，并与较低剂量补充的新鲜酶一起用于随后的水解循环。水解循环之间的酶活性损失被改进的整个工艺优势抵消。
[0014]附图简要说明
[0015]图1显示在72小时SSF工艺体系的实验中乙醇产量作为时间和纤维素酶剂量的函数。
[0016]图2显示6小时水解后的葡萄糖浓度作为表示为FPU/g DM的纤维素酶剂量的函数。
[0017]图3显示实施例3中报道的实验方案。
[0018]图4显示使用经优化用于木质纤维素生物质转化且由N0V0ZYMES?提供的可商购的纤维素酶制剂来实施本发明的方法时，每个回收循环后获得的乙醇浓度。
[0019]图5显示使用经优化用于木质纤维素生物质转化且由GENENC0R?提供的可商购的纤维素酶制剂来实施本发明的方法时，表示每个回收循环后的纤维素酶活性回收的6小时预水解后的葡萄糖浓度。
[0020]一些实施方案的详细说明
[0021]提供具有改进效率的生物乙醇生产中加工木质纤维素生物质的方法。
[0022]从2000年以来，最大的商业纤维素酶生产者已经集中研究以在第二代生物乙醇生产中降低生产成本和改进经优化用于转化木质纤维素生物质的纤维素酶混合物的特定活性。特别是N0V0ZYMES?和GENENC0R?在2009-2010年分别以商标CELLIC CTEC2?和ACCELLERASE1500?推出新的商业纤维素酶混合物。
[0023] GENENC0R?在2009年推出专门为第二代生物炼制开发的可商购生物质酶的改进变型，并以商标ACCELLERASE1500?销售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆和针叶木浆的一系列预处理原料。ACCELLERASE 1500?的产品信息页指出剂量优化范围是0.1-0.5mL/g纤维素或大约0.05-0.25mL/g DM预处理生物质。
[0024]N0V0ZYMES?在2010年推出专门为第二代生物炼制开发的可商购生物质酶的改进变型，并以商标CELLIC CTEC2?销售。已表明其成功地水解包括甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆和针叶木浆的一系列预处理原料。N0V0ZYMES?分发的产品信息材料，具体地是"FuelEthanol Application〃材料中提供的CELLIC CTEC2?的〃剂量指引〃，指出从低到高的剂量范围，其对应于0.015-0.06g酶/g纤维素或约0.0075-0.03g酶/g DM预处理生物质的范围内的〃商业上可行的纤维素水解的目标〃。
[0025]〃纤维素酶活性〃是指纤维素中l，4-13_D-糖苷键的酶水解。在从细菌、真菌或其它来源中获得的商业或其它纤维素酶制剂中，纤维素酶活性通常包含不同酶活性的混合，所述酶包括与β -葡糖苷酶一起分别催化1，4-β -D-糖苷键内水解和外水解的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶(也称为纤维素二糖水解酶)，所述P.葡糖苷酶将外切葡聚糖酶水解的低聚糖产物水解成单糖。经优化用于水解木质纤维素生物质的商业混合物经常还含有用于转化木质纤维素生物质但本身不是纤维素酶的酶，如催化与木质纤维素材料中的纤维素有关且由各种单糖组成的杂聚合物半纤维素水解的半纤维素酶，所述单糖最特别是木糖，但还包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和其它糖。
[0026]如现有技术众所周知的，总的纤维素酶活性，包括不同纤维素酶的任何混合物，可便利地测定为称为__滤纸单位__的单一活性表达。如本文所使用，术语__滤纸单位"(FPU)是指通过 Adney, B.和 Baker, J., Laboratory Analytical Procedure#006,^Measurementof cellulase activity", 1996 年 8 月 12 日，USA National RenewableEnergy Laboratory(NREL)的方法测定的滤纸单位,上述文献以其整体方式通过引用明确地引入本文。本领域技术人员将容易理解，FPU提供纤维素酶活性的量度，但是其它的酶活性可有用地包括在纤维素分解酶的有效混合物中，包括但不限于半纤维素酶活性。
[0027]在丹麦Fredericia的INBIC0N?实验室，我们测定经优化用于木质纤维素生物质水解并由GENENC0R?以商标ACCELLERASE 1500?销售的商业纤维素酶制剂的以滤纸单位计的纤维素酶活性为约60 (FPU)/ml。因此，可将GENENC0R?建议的优化范围重新计算为约3 — 15FPU/g DM预处理生物质。我们测定经优化用于木质纤维素生物质水解且由N0V0ZYMES?以商标CELLIC CTEC2?销售的商业纤维素酶制剂以滤纸单位计的纤维素酶活性为约120FPU/g酶。因此，可将由N0V0ZYMES?建议的〃商业上可行的纤维素水解的目标.‘剂量重新计算为约1.4FPU/g DM。
[0028]考虑到纤维素酶剂量对第二代生物乙醇生产的商业化可行性至关重要，现有技术之前已寻求使纤维素酶剂量最小化。例如参见参考文献9。
[0029]相反地，我们已经发现，令人惊讶地，使用SHF或SSF时，使用高初始酶载量(至少15FPU/g DM)可获得更大的整个工艺优势。
[0030]在一些实施方式中，本发明提供一种高的酶剂量回收方案，由此在多个水解循环中保持至少15FPU/g DM或至少12FPU/g DM或至少10FPU/g DM的纤维素酶活性水平。仅需要在初始水解循环中添加高的酶剂量。通过从之前循环中回收纤维素酶活性和补充较低剂量的新鲜纤维素酶制剂，而在随后的水解循环中保持高的酶水平。
[0031]相对于低剂量体系，高剂量体系即使在每升乙醇的酶消耗量增加的情况下，也提供整体优势。使用高剂量体系导致水解时间急剧缩短。该水解时间的缩短提供生产规模的直接利益，因为降低了资本成本(可使用更小的水解罐)和增加了生产能力(实现更高的生物质生产能力)。此外，在高剂量体系中，更完全地水解木质纤维素生物质，以致转化率接近100%。这反过来降低了每升乙醇的总生物质成本。在其它情况下，可如此显著地改进水解产率和回收纤维素酶活性至如此高的程度，以致与使用商业酶供应商推荐的较低酶剂量下可获得的相比，高剂量体系提供相当或甚至更低的每升乙醇的最终酶消耗量。
[0032]表1显示在使用本发明方法的多个水解循环中可大致保持的理论高初始纤维素酶剂量的计算值，其中每升乙醇的酶成本与低剂量体系相当。所示的纤维素酶活性回收水平限定了在每个水解循环中通过低剂量补充可维持的高酶剂量的水平。所示的补充剂量简单地是[1-(回收率％/100)]*(实现完全转化所需的酶剂量)。理论高剂量计算基于假定水解中的转化率为100%。因此，理论可持续高剂量应通过系数(高剂量下的实际转化率)/100%来校正。相当的酶成本表示，通过10个具有补充的回收循环在完全转化下生产每升乙醇的总酶消耗量相当于通过10个普通发酵循环在5FPU/g DM和在相当的DM下生产每升乙醇的总酶消耗量。〃普通发酵〃是指使用5FPU/g DM的经优化用于木质纤维素生物质水解且由N0V0ZYMES?以商标CELLIC CTEC2?提供的商业纤维素酶制剂在50°C下预水解经蒸汽预处理的小麦秸杆6小时，然后使用普通面包酵母在30-33°C下SSF144小时的标准条件。
[0033]如下确定表1的计算:每升乙醇目标物的相当酶成本是在SSF体系中144小时，25% DM下，5FPU/g DM下的典型乙醇产量。该典型产量是70%的理论转化率，其在参考DM水平下产生152升乙醇。
[0034]因此，所述相当目标是5FPU/152升乙醇或0.0328947FPU/升乙醇，其中g DM是常数。
[0035]参考DM水平下的100%转化率是218升乙醇。利用在该SSF体系中超过15FPU的任何剂量可实现完全转化的假设，我们计算了在10个具有酶补充的回收循环中使用的总酶。
[0036]我们得到[总酶FPU]/2180升乙醇=0.0328947FPU/升乙醇，其中g DM是常数。
[0037]术语[总酶FPU]是回收率％和由X给出的起始酶浓度的函数，其可求解以满足条件[总酶]=(2180) * (0.0328947) = 71.7
[0038]如下确定X的计算:[((9个回收循环)*(1-回收率％补充)+l)*X] =71.7
[0039]因此，例如，在15FPU和58%回收率时的计算为:[总酶FPU] = 15+9* (6.3补充剂量)=15+56.7 = 71.7
[0040]类似地，例如，在18.1FPU和67%回收率时的计算为:[总酶FPU] = 18+9* (5.96补充剂量)=18.1+53.6 = 71.7
[0041]表1.由给定的平均纤维素酶实际回收率％下的以FPU/g DM计的给定补充剂量计算的在每升乙醇相当酶 成本下可持续的以FPU/g DM计的理论高纤维素酶剂量
[0042]