专利名称：一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法食物过敏是对食物中蛋白质分子产生的一种不良免疫反应。流行病学调查显示， 25%以上的人群受到过敏疾病的困扰。世界卫生组织(WHO )将牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、 蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦这8类食物定为常见的过敏食物。鸡蛋中的蛋白质属于优质蛋白质，除了含有成年人所需要的八种必需氨基酸外， 还含有婴幼儿必须通过膳食补充的组氨酸，更是唯一一个蛋白质生物价达100的天然食物。然而正是这些对人体相当有益的蛋白质却可能成为儿童患过敏性疾病的祸首。不仅是儿童，某些先天性遗传缺陷的成年人同样有着对鸡蛋过敏的烦扰。据报道，鸡蛋过敏的高危人群为婴幼儿和儿童，是儿童继发性营养不良的原因之一。迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用带鸡蛋的食物是鸡蛋过敏患者的最佳选择。然而鸡蛋营养丰富，若从鸡蛋过敏患者的膳食中除去鸡蛋，势必造成其营养不均衡。而且，由于现在食物配料的多样化，使食物的组成变得十分复杂，鸡蛋过敏患者很难避免遭受危害，因此，鸡蛋过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危急生命，值得我们去关注和研究。鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中有4种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，为鸡蛋的主要过敏原，它们分别是卵类黏蛋白、卵白蛋白(OVA)、卵转铁蛋白和溶菌酶。目前国内检测卵白蛋白主要利用进口的酶联免疫检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，但是价格昂贵。
本发明提供一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法，目的是建立能稳定、高效分泌抗卵白蛋白的杂交瘤细胞株，从而为研制卵白蛋白双抗夹心ELISA试剂盒奠定基石出。本发明采取的技术方案是(1)免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速的免疫方法用lmg/mL的卵白蛋白100μ L与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30 μ L ；首免后七天用 lmg/mL的BALB/C 100 μ L与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻后注射方法同上，首次免疫后 14天断尾采血检测小鼠血清效价；(2)细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，具体方法如下强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1 :5 10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37°C水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换 HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价， 筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20. 3%和73. 1%，阳性率分别为0和1. 78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5557，分类命名产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为 4. 8 X IO8M"1 ο本发明还包括单抗亚类测定及单抗的大量制备，用鼠免疫球蛋白亚类检测试剂盒鉴定单抗亚类，用小鼠体外诱生腹水法大量制备腹水；本发明还包括单抗分子量及腹水蛋白含量测定将纯化前和纯化后的腹水经变性SDS-PAGE电泳后，以Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据抗体轻链和重链在凝胶中的迁移情况，计算抗体分子量。采用紫外分光光度法测定腹水蛋白含量，分别测定^Onm和^Onm处的吸光值，按下面的经验公式计算蛋白含量蛋白浓度(mg/ml) =1. 450 X OD280-O. 745X0D26(i。本发明采用高纯度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠，筛选出一株能稳定分泌抗卵白蛋白的杂交瘤细胞株，为进一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA检测试剂盒奠定了基石出。

采用两种免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一种是足垫快速免疫方案用lmg/mL的 0VA100 μ L与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min。使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30 μ L。首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L与等量的弗氏不完全佐剂混合均勻后注射方法同上， 首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价。另一种是常规免疫方案首次免疫乳化方法同足垫快速免疫法，腹腔及背部皮下多点注射100yg/100yL的卵白蛋白，两周后进行加强免疫，100 μ g/100 μ L抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫每次间隔两周，四免后三天断尾检测小鼠血清效价。实施例2细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆具体操作步骤如下
强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏(足垫免疫小鼠无菌取出胭淋巴结)，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液(或者用注射器研磨胭淋巴结制备细胞悬液)，按1 :(5 10)的比例与SP2/0细胞充分混合，在37°C水浴下与50%PEG1000进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的 HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔lOOul，放入37°C、 5%C02培养箱中培养，并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基，待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高，细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止，先后两次细胞融合的融合率分别为20. 3% 和73. 1%，阳性率分别为0和1. 78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E9，2011年11月7日在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5557，分类命名产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株。实施例3单抗亚类鉴定及腹水大量制备具体方法如下
(1)用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4°C过夜；
(2)PBST洗涤3次，甩干；
(3 )加入适当稀释的腹水或细胞培养上清，37°C，Ih ；
(4)PBST洗涤3次，加入单抗亚类鉴定试剂，37°C，Ih ；
(5)PBST洗涤3次，甩干；
(6)每孔加入IOOul底物溶液，37°C显色15min，酶标仪读值判断阳性结果。单克隆抗体亚类鉴定


本发明涉及一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于生物检验检疫领域。免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方法细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，为进一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA检测试剂盒奠定了基础。