专利名称：高密度微生物混合发酵在磷限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法伴随石油化工的发展，合成塑料已成为人们生活和生产密不可分的エ业产品。但是大量不可降解塑料的废弃已造成愈来愈严重的“白色汚染”，日益威胁着人类赖以生存的环境，因此开发可生物降解的塑料已成为当务之急。目前采用生物技术生产的生物可完全降解的塑料中，研究得比较多的有两类聚乳酸和聚羟基烷酸酯。尤其后者的物化性能与聚丙烯相近，还具有生物相容性、光学活性、压电效应、低透氧性、抗紫外线和抗凝血性等许多独特的优点，在医用产品领域也有广泛的用途。临床医学研究表明含苯基功能团的有机物苯乙酸和苯丁酸等具有抗肿瘤、镇痛和化学预防治疗等功能。如果将苯基功能团引入生物高分子聚合材料一一聚羟基烷酸酯中，合成出具有优良物理化学和机械性能的含苯聚羟基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解过程中缓慢释放出含苯基功能团的有机酸如苯乙酸、苯丁酸等的特点，从而使生物可降解医用材料聚羟基烷酸酯在使用过程中具有抗肿瘤、镇痛等新的医学作用，可为扩大该类生物高分子材料在医学方面的应用奠定良好的基础。不含苯基功能团的聚羟基烷酸酯的生物合成技术已经基本成熟，如利用发酵法合成聚羟基丁酸酯(PHB)的浓度可达到每升140克，合成的羟基丁酸和羟基戊酸共聚物的浓度能达到每升50 90克左右，这使它们的生产成本大幅度降低，具备了エ业化规模生产的条件。但是利用微生物以含苯有机物(如苯戊酸、苯乳酸等)为碳源合成含有苯基功能团的聚羟基烷酸酯吋，由于通常微生物代谢含苯有机物的速率较低，而且有机物碳源对細胞生长有明显抑制作用等原因，使得最终得到的细胞浓度和产物浓度都较低。近期报道的两段流加式高密度发酵合成聚羟基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有机物碳源对細胞生长抑制作用，从而使得发酵果汁最终得到的细胞浓度可以达到35. 3克/升，产物聚羟基苯烷酸酯的浓度达到12. 3克/升。但发酵过程分为两段，两段之间要调换不同的调节pH值所用的碱液，同时两段发酵过程中补给的料液也不同，使得发酵过程操作、控制较为复杂。再加之发酵过程中仅仅利用単一菌种如heudomonas putida发酵合成的含苯羟基烷酸酯共聚物中、单体绝大部分都是中长链(六个碳或以上)烷酸酯単体，短链G个碳或以下，或5个碳)烷酸酯単体含量低，导致其材料难于加工成型，大大地限制了它的应用范围。此外，利用単一菌种微生物发酵合成聚羟基烷酸酯吋，因微生物特性所定，其代谢产物聚羟基烷酸酯往往主要由短链单体組成，或者主要由中长链单体組成，很难调节和控制聚羟基烷酸酯产物中短链单体和中长链单体的比例，以使其产物的物理化学性能难以调控，大大地限制了它的使用范围。
本发明针对现有技术的上述不足，提供ー种利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给来合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酷，井能有效地大范围调控其产物組成、而且操控过程简单的高密度微生物混合发酵在磷限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为高密度微生物混合发酵在磷限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，合成方法包括(1)在发酵培养基中加入磷酸盐作为微生物生长代谢所必须的磷营养元素的供体，同时在发酵培养基中加入含苯有机物和糖作为碳源，然后将两种或两种以上的微生物接种到发酵培养基中于发酵罐内进行混合发酵培养；(2)以Iwm的流量将无菌空气或富氧气体(如エ业级的氧气)连续通入步骤(1) 中的发酵罐内，控制发酵罐的搅拌转速为150 800转/分钟，发酵温度为微生物生长的适宜温度，发酵液中溶解氧浓度高于微生物生长代谢的需求值；并利用氨水调节PH为微生物生长的适宜PH值(如果不用氨水而用氢氧化钠溶液来调节pH值时，在发酵过程中需要补给一定量的氮源如硫酸铵，以保证发酵过程中微生物对氮的需求量)；(3)发酵过程中利用在线信号(如溶氧浓度、PH、在线糖浓度分析仪等)判断发酵过程中碳源(糖和含苯有机物等)的消耗量，适时流加碳源以保证微生物的生长所需碳源， 使发酵罐内含苯有机物的浓度在0. 5克/升以下，不对微生物生长造成抑制作用；糖的浓度不大于20克/升；随着发酵的进行，发酵液中营养元素磷的浓度不断降低，当发酵液中的磷浓度逐渐降低至0. 1克/升吋，造成发酵液中磷源的供给不足，实现了磷限制；此吋，流加到发酵罐内的含苯有机物和糖通过微生物代谢合成转化为聚羟基苯烷酸酯(是指磷限制之后再流加的含苯有机物和糖)。在出现磷限制以后，若要提高产物中苯戊酸単体的含量，可适当提高发酵罐内含苯有机物的浓度，但为了防止含苯有机物对微生物生长代谢产生的抑制作用，其浓度不得高于1.5克/升。本发明上述的两种或两种以上的微生物菌种为有能力将碳源转化为含苯聚羟基烧酸酉旨的微生物，如Pseudomonas oleovorans (食油假单胞菌)，Pseudomonas putida(恶臭イ131 单胞囷ノ，Pseuaomonas hydrogenovora, Caldimonas taiwanensi, Ralstonia eutropha(真养产碱杆菌)等中的两种或两种以上。本发明上述步骤(2)中所述的“微生物生长的适宜温度”和“微生物生长的适宜pH 值”，因为适宜温度和PH与菌种种类有关，根据具体采用的菌种种类可以给出适宜的温和 PH值，如本发明采用的适宜温度可以为28 38°C，如以恶臭假单胞菌I^seudomonas putida KT2442和真养产碱杆菌fellstonia eutropha混合培养为例，适宜pH值为7. O士2。上述所述的含苯有机物为苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的ー种或ー种以上的混合物。上述所述的糖为葡萄糖、蔗糖、木糖等中的ー种或ー种以上的混合。本发明的优点和有益效果如下1.不同的微生物可将碳源转化为不同的聚羟基烷酸酷，如Ralstonia eutropha 可将葡萄糖转化为聚羟基丁酸酯(属于短链聚羟基烷酸酷，比较脆、硬)，而heudomonasPUtida可将葡萄糖转化为聚羟基癸酸-月桂酸酯共聚物(属于中长链聚羟基烷酸酷，比较柔、有弾性)。本发明利用不同微生物的混合发酵，可以合成出既含有短链也含有中长链的聚羟基烷酸酯；同时通过混合碳源补给，利用不同微生物在不同碳源环境下生长代谢的差异性，可实现大范围调控产物中短链和中长链单体的比例，达到调控产物組成的目的，从而改善产物的物理化学性能，扩大产物的应用范围。2.本发明采用在磷限制的情况下高效合成含苯聚羟基苯烷酸酷，发酵过程不需要分为两个阶段，也避免了氮限制的情况下发酵过程中间需要调换调控PH的碱性溶液，使得发酵过程简单，易于操控。另外，采用磷限制进行发酵时，发酵结束时的细胞浓度与初始发酵液中加入的磷元素浓度有关，一般初始磷元素浓度越高，发酵结束时细胞浓度越高，通过控制初始发酵液中磷元素的浓度，从而可实现调控发酵结束时的细胞浓度。采用这ー技术 エ艺，可以实现高密度发酵合成聚羟基苯烷酸酯的目的，最终发酵液中干细胞浓度最高可以达到53. 2g/L，产物聚羟基苯烷酸酯的含量达到40. 2%。。上述的恶臭假单胞菌I^seudomonas putida KTM42来源于韩国科学技术院生物化学工程实验室，真养产碱杆菌Ralstonia eutropha购于英国菌种保藏中心。实施例1以表2中所述的实施方案1实施，即初始发酵培养基中KH2PO4的初始浓度为1. 5 克/升。具体过程如下配制1. 5L发酵培养基(其组成见表1，其中KH2PO4中的磷作为“磷营养元素供体”)，装入5L发酵罐(发酵罐Model :KF-5, K0BI0TECH CO.，LTD韩国生物技术有限公司， 型号KF-5)中并灭菌，灭菌后分別接入IOOmL恶臭假单胞菌的种子液和IOOmL真养产碱杆菌的种子液(液体种子发酵培养基中蔗糖浓度为5g/L，其它成分的浓度与基本发酵培养基的相同，见表1，种子液按照常规技术制备)。在30°C、初始搅拌转速220转/分钟下开始发酵培养，再以Ivvm的流量通入无菌空气或富氧气体，保持发酵液中溶氧浓度高于20% (通过调节搅拌转速或气体中氧气的浓度使溶解氧浓度高于20%，以同温同压下空气中的氧在发酵液中的饱和溶解度值为100%为參照)；用36%氨水调节pH为7. O。在线监测发酵罐中PH和溶解氧浓度的变化，当二者同时迅速上升时，说明培养基中碳源耗尽，需要流加碳源(补料I+IV)，使发酵罐中蔗糖浓度保持在10 15克/升之间，使苯戊酸的浓度小于0. 5 克/升；随着发酵过程的进行，当磷元素的浓度降低到0. 1克/升吋，在补充蔗糖的同时补充苯戊酸，使发酵液中苯戊酸的浓度在0. 5 1克/升之间，这样可以提高含苯聚羟基苯烷酸酯中苯戊酸単体的比例，直至发酵结束。实施例2以表2中所述的实施方案2实施，即初始发酵培养基中KH2PO4的初始浓度为2. 5 克/升，补充的碳源为补料II+IV。其他过程同实施例1。实施例3以表2中所述的实施方案3实施，即初始发酵培养基中KH2PO4的初始浓度为3. 5 克/升，补充的碳源为补料II+IV。其他过程同实施例1。利用上述发酵方法，发酵终了时细胞浓度、产物聚羟基苯烷酸酯在细胞中的含量、 发酵总时间在表4中给出。表1发酵培养基及微量元素溶液的组成
本发明公开一种高密度微生物混合发酵在磷限制下合成含苯聚羟基烷酸酯的方法，(1)在发酵培养基中加入磷酸盐、作为碳源的苯有机物和糖，然后将两种或两种以上的微生物接入进行混合发酵；(2)将无菌空气或富氧气体连续通入发酵罐内，控制发酵罐的转速、温度、pH值；(3)发酵罐内含苯有机物的浓度在0.5克/升以下；糖的浓度≤20克/升；发酵液中磷浓度不断降低，当发酵液中的磷浓度降至0.1克/升实现磷限制；此时，流加到发酵罐内的碳源转化为聚羟基苯烷酸酯。本发明具有利用微生物混合发酵、多种碳源分段补给来合成既含有短链单体又含有中长链单体的含苯聚羟基烷酸酯，并能有效地大范围调控其产物组成、而且操控过程简单的优点。