专利名称：氯胺酮和其代谢物的半抗原、免疫原、抗体和偶联物的制作方法图1，第665页)。产生的抗体显示对PCP和相关化合物的高水平交叉反应性，但对氯胺酮的低水平交叉反应性，如高IC50值所示(表1，第667页)。氯胺酮的交叉反应性，又一次证实缺少氯和羰基是有意义的。Leung等(′Comparative pharmacology in the rat of ketanine and its twoprincipal metabolites，norketamine and(z)-6-hydronorketamine，J Med Chem(1986)，29(11)，2396-2399)描述了从氯胺酮的初级代谢物，去甲氯胺酮合成(z)-6-羟基去甲氯胺酮(一种氯胺酮的次级代谢物)。他们也进行了氯胺酮、去甲氯胺酮和(z)-6-羟基去甲氯胺酮在大鼠上比较药理学研究。Leung等人既没有公开也没有建议怎样制备针对氯胺酮或去甲氯胺酮的半抗原、免疫原和抗体。发明详述在第一方面，本发明提供了在去甲氯胺酮的N位置用交联剂派生半抗原。优选地半抗原具有下面的结构式 其中R是二价键，X是末端基团。最优选地，R包括取代的或未取代的、直链的或支链的、饱和的或未饱和的亚烷基成分；和X包括羧酸或其酯；一种胺、马来酰亚胺、卤代羧酸或其酯、醛、二硫吡啶成分、乙烯砜成分或硫代羧酸或其酯。所以，在优选的实施方案的通式中，交联剂包括-R-X。在本发明最广泛的方面中，交联剂也可以包括-R-X。更优选地，R是C1-5，最优选地C3，取代或未取代，直链，饱和的亚烷基成分。最优选地，如果存在取代基时，取代基是羰基基团。
优选地，X选自羧酸，硫代羧酸，二硫吡啶，马来酰亚胺，或醛成分。最优选地，X是羧基(COOH)或硫代乙酰基(SCOCH3)成分。
最优选地，半抗原选自下面去甲氯胺酮半抗原衍生物N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)；N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮(半抗原B)；和N-(3′-乙酰基硫代丙酰氨基)去甲氯胺酮(半抗原C)。
这些新型半抗原是通过利用适当的交联剂对去甲氯胺酮进行N-衍生化，优选N烷基化制备。
得到的半抗原进一步在这些功能化位置进行修饰，以便与修饰或未修饰的载体物质结合提供生产抗体的免疫原，和具有良好的敏感性和特异性的结合物(示踪物)，以检测或测定氯胺酮和去甲氯胺酮。
本发明公开了去甲氯胺酮的第一半抗原衍生物的制备。通过将它们与修饰或未修饰的产生抗原性的载体物质结合，来制备免疫原。然后，对哺乳动物寄主注射得到的免疫原，引发特异抗体的产生，优选多克隆抗体，然后用来研发氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性免疫测定，利用与标记试剂结合的半抗原作为检测试剂。
本发明也提供了包括本发明的半抗原与产生抗原性的载体物质结合的免疫原。优选载体物质是蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。
另一方面本发明涉及抗本发明免疫原的抗体，抗体能够结合至少一个去甲氯胺酮或去甲氯胺酮的结构表位。优选结构表位是氯胺酮和去甲氯胺酮的芳基环己酮成分，更优选是氯苯基环己酮成分，最优选是邻-氯苯基环己酮成分。
另一方面本发明涉及具有氯胺酮特异性的抗体，特征是与去甲氯胺酮具有超过100％，优选地100-175％的交叉反应性。
另一方面本发明包括本发明的半抗原共价结合可检测的标记试剂的偶联物。优选地，该标记试剂选自酶、发光物质、放射活性物质或其混合物。更优选地，该标记试剂是酶，优选地是过氧化物酶，最优选地是辣根过氧化物酶(HRP)。或者，或另外，发光物质可以是生物发光、化学发光或荧光物质。
本发明另外提供了制备抗体的方法，该方法包括免疫(接种)动物，优选地是脊椎动物，最优选地是哺乳动物，重复注射本发明的免疫原，和从被免疫(接种)的动物收集得到的血清。优选地，该过程进一步包括将所述的血清抗体固定到载体上，优选地是固体支持物，最优选地是聚苯乙烯固体支持物。优选地，该抗体是多克隆抗体。或者，该抗体是单克隆抗体。
另一方面本发明包括检测或测定样品中氯胺酮和去甲氯胺酮的方法，该方法包括将样品与本发明的偶联物或其混合物接触，和与本发明的抗体或其混合物接触；检测或测定结合的偶联物；和从校正曲线推测样品中氯胺酮和去甲氯胺酮的存在或其数量。
另一方面本发明包括检测或测定氯胺酮和去甲氯胺酮的试剂盒，该试剂盒包括本发明的偶联物或其混合物；和本发明的抗体或其混合物。该试剂盒选择性地可以包括所述偶联物和所述抗体用于检测或测定样品中的氯胺酮和去甲氯胺酮的使用说明。
优选地，该样品是溶液，如生物液体。更优选地该样品是血清或尿。
在本发明的方法和试剂盒中，优选地，(免疫原和偶联物的)各个交联剂是不同的。
另一方面本发明包括本发明的偶联物或其混合物与本发明的抗体或其混合物在检测或测定样品中如生物液体中氯胺酮和去甲氯胺酮中的应用。
半抗原的制备半抗原N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮A，N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮B和N-(3′-乙酰基硫代丙酰胺基)去甲氯胺酮C根据附图2制备。用溴在四氯化碳对(邻—氯苯)环戊酮1中进行溴化得到了α-溴-(邻-氯苯)环戊酮2。用液氨处理溴代酮2得到1-[(邻-氯苯)亚胺甲基]环戊醇3。去甲氯胺酮4是在200℃时，醇亚胺3热重排后得到的。在氰氢化硼存在下，用琥珀醛酸(succinicsemialdehyde)对去甲氯胺酮4进行N-烷基化得到N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)。在乙醇碱性溶液中，将去甲氯胺酮4与乙酸碘代丙硫酯(iodopropyl-thioacetate)反应得到N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮(半抗原B)。通过去甲氯胺酮4与3-乙酰基硫代丙酸在EDC盐酸和吡啶存在时，在DMF中反应得到了N-(3′-乙酰基硫代丙酰胺基)去甲氯胺酮(半抗原C)。
根据附图3，用6个步骤制备半抗原6-O-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮D。首先，在苯中，在碳酸钠(Na2CO3)存在时，去甲氯胺酮4与氯甲酸甲酯回流，首先转化成氨基甲酸甲酯衍生物5。用二异丙胺锂(LDA)和三甲基甲硅烷基氯(TMSC)在四氢呋喃(THF)中，在-78℃处理氨甲酸甲酯5得到相应的三甲基甲硅烷基烯醇醚6。在Na2CO3存在下，用间-氯过苯甲酸(MCPBA)氧化6得到N保护的6羟基去甲氯胺酮7。在碱性条件下用烯丙基溴对6进行O-烷基化得到衍生物8。利用三甲基甲硅烷基碘除去8的甲氧基羰基保护基团，接着在氯仿中，在2′，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)催化剂存在下回流，与硫代乙酸反应得到中等产量的半抗原6-O-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮D。
免疫原和偶联物的制备虽然本发明的半抗原提供了确定的结构表位，但它们本身不具备免疫原性，所以需要与载体物质结合，当对宿主动物给药时，将引发免疫原性应答。适当的载体物质通常含有聚(氨基酸)片段并且包括多肽、蛋白质和糖蛋白。有用载体物质的例证性实例是小牛血清白蛋白(BSA)、鸡蛋白蛋白、小牛γ球蛋白、甲状腺素结合球蛋白，钥孔戚血蓝蛋白(KLH)等。或者，可以利用具有足够数目氨基的合成聚(氨基酸)，如赖氨酸，也可以是其他具有反应官能团的合成或天然多聚体物质。特定地，可以将碳水化合物、酵母或多糖可以与半抗原结合制备免疫原。
本发明的每个半抗原也可以与标记试剂，如酶(例如，辣根过氧化物酶)，具有荧光特性的物质或放射活性标记物结合用于制备偶联物(或检测试剂)，用于免疫测定。荧光物质可以是例如荧光素或其衍生物的单价残基。
在用本发明的半抗原制备免疫原或偶联物时，若其中存在硫代基团，如半抗原B，C和D，首先可以利用杂双功能接头将马来酰亚胺，卤素或乙烯砜基团导入到载体物质或标记试剂(酶或标记物)中；这些杂双功能接头如N-(g-马来酰亚胺基丁酰氧)琥珀酰亚胺酯(GMBS)；琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)；(m-马来酰亚胺基苯酰基)-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)；琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；溴乙酰基甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺；N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)；或乙烯砜(Pierce化学公司，美国)。然后，这样修饰的载体物质，或标记试剂可以通过半抗原，例如半抗原B，C和D上的硫基团结合起来。对于没有硫基团的半抗原，如半抗原A，结合是与没有预先修饰的载体物质或标记试剂，利用标准结合方法，如混合甲醛，EDC或半抗原的琥珀酰亚胺活化来进行的。
为了证明半抗原与载体物质具有足够结合量，在免疫(接种)之前，利用基质辅助UV激光吸收/离子时间-飞行质谱(MALDI-TOF MS)对每个免疫原进行评估。本发明的各个免疫原适用于免疫接种，以便产生用于检测氯胺酮和去甲氯胺酮的抗体。
免疫原的MALDI-TOF分析的一般过程利用Voyager STR生物光谱仪研究站激光吸收质谱仪结合延迟萃取进行MALDI-TOF质谱分析。用0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液稀释每个待分析样品，制备1mg/ml样品溶液。利用芥子酸作为基质分析等分试样(1μl)，小牛血清白蛋白(Fluka)用作外部校准样品。附图5显示BSA载体物质的分析结果。正如将要看到的，出现的主要信号显示这一样品的平均质子化质量是m/z 66,404。在m/z 33,200的信号是与双电荷形式的主要成分一致。另外观察到的信号包括m/z 13,605。
抗血清的制备为了生产多克隆抗血清，将本发明的各个免疫原与弗氏佐剂混合，将混合物注射到宿主动物，如兔子、羊、小鼠、豚鼠或马体内。进一步注射(加强)，取血清样评估抗体效价。当获得了最佳效价时，取宿主动物血，生产适当体积的特异抗血清。抗体纯化程度取决于所应用目的。对于许多目的来说，不需要纯化。但是，在其他情况中，如在固体支持物上固定抗体，进行纯化步骤以除去不需要的物质和消除非特异的结合。
本发明中制备的特异抗体可用作免疫测定中的试剂，用于检测或测定生物液体中的氯胺酮和去甲氯胺酮。本发明的抗体能够与氯胺酮和去甲氯胺酮的芳基环己酮成分结合，优选地与氯苯环己酮成分结合，最优选地与邻—氯苯环己酮成分结合。
附图简要说明通过详细描述典型技术方案及其附图，本发明的上面和其他的特征和优点将变得更为清晰。
图1例举说明氯胺酮和它的代谢物的结构；图2例举说明制备半抗原A，B和C的反应路线；图3例举说明制备半抗原D的化学反应；图4例举说明氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性ELISA微量滴定板试验；图5例举说明BSA载体物质的MALDI-TOF质谱图；图6例举说明免疫原A的MALDI-TOF质谱图7例举说明溴乙酰基甘氨酸修饰的BSA的MALDI-TOF质谱图；图8例举说明免疫原B的MALDI-TOF质谱图；图9例举说明免疫原C的MALDI-TOF质谱图；图10例举说明去甲氯胺酮的13C-NMR图。
图11例举说明半抗原A的13C-NMR图。
图12例举说明半抗原B的13C-NMR图。
实施例实施例1制备a-溴-(邻-氯苯)环戊酮2在惰性气体下向溶解在25毫升无水四氯化碳中的(邻-氯苯)环戊酮1(21.0g，0.1mol)的溶液中，0℃下，在30分钟的时期内，滴加溶于100毫升四氯化碳中的溴(16.17g，0.1mol)。在加入所有溴后，形成了橙色悬浮液。在室温下，搅拌悬浮液30分钟，然后用10％(w/v)的二硫化钠(2×100ml)洗涤。在无水硫酸钠上干燥有机相，过滤和在减压条件下蒸发至干，得到黑棕色油状的α-溴-(邻-氯苯)环戊酮2(24.0g，83％)，不进行纯化用于实施例2。
实施例21-[(邻-氯苯)亚胺甲基]环戊醇3的制备在-78℃下，向液氨溶液(100ml)用1小时分批加入粗制化合物2(24.0g，0.0834mol)。然后，搅拌混合物4小时，允许氨蒸发过夜。用四氢呋喃悬浮得到的固体残留物，过滤除去沉淀。在减压条件下浓缩滤液，用石油醚研磨得到的残留物。滤出得到的沉淀，在P2O5下干燥过夜得到白色固体的1-[(邻-氯苯)亚胺甲基]环戊醇3的游离碱(16.8g，90％)。
IR(KBr)3210.9；1635.9；763.3cm-1NMR13C(CDCl3)183.4；138.2；130.3；130.0；129.8；127.2；84.9；38.6(2C)；23.6(2C)ppm.
M.P.(石油醚)88-90℃将20g(0.089mol)化合物3的游离碱溶解于25ml异丙醇中，在该溶液中加入100毫升乙醚的盐酸溶液(2N)制备1-[(邻-氯苯)亚胺甲基]环戊醇盐酸盐3。然后，搅拌混合物10分钟，过滤得到的沉淀，用乙醚洗涤，干燥得到白色固体的混合物3的盐酸盐(23.14g，100％)。
M.P.144-146℃实施例3[2-氨基-2-(邻-氯苯基)]环己酮(去甲氯胺酮)4的制备在200℃，化合物3的盐酸盐(20g，0.077mol)以一份一份地加入到250ml的Dowtherm-ATM中，在200℃搅拌该混合物15分钟。在10℃冷却该反应混合物，除去形成的沉淀，通过过滤丢弃。用醚中稀释滤液，用水萃取(2×200ml)。用醚洗涤合并的水相，用6N氢氧化钠调节碱性，用醚萃取(2×150ml)。用水洗涤合并的醚层，干燥和浓缩至干。在硅胶(70％己烷/30％乙酸乙酯)上快速色谱纯化残留物，得到去甲氯胺酮游离碱4(13.75g，80％)，无色油状物。
IR(薄膜)3381.47；3310.15；3064.64；1939.96；2864.94；1712.61和757.0。
NMR13C(CDCl3)212.85；140.47；133.11；131.08；129.01；128.36；127.24；66.52；41.35；39.06；28.42；22.23(图10)。
实施例4N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮-半抗原A的制备在0℃时向15％的琥珀醛酸溶液(5ml，8.018mmol，811.7mg)中加入四氢呋喃(20ml)、去甲氯胺酮4(1.38g，6.17mmol和氰基硼氢化钠(388mg，6.17mmol)。在室温下搅拌该混合物2小时，薄层层析(10％甲醇的氯仿液)证明，起始物质(去甲氯胺酮4)不再存在。向这一溶液中，加入20ml 1N盐酸，再搅拌该反应混合物1小时。在减压下蒸发四氢呋喃，用氢氧化钠(1N)将剩余水溶液中和到pH7，并且用氯仿(3×50ml)萃取。用5％的碳酸氢钠溶液(50ml)、水(50ml)洗涤合并的有机层，在无水硫酸钠上干燥，过滤和浓缩至干。通过在硅胶上层析(10％甲醇的氯仿液)纯化残留物，得到0.8g(38.8％)的N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)的白色吸湿泡沫。
IR(薄膜)3354.76；3056.10；1721.05；1265.70；736.68。
NMR13C(CDCl3)208.26；175.37；135.33；134.27；131.47；129.85；129.76；127.08；70.49；42.72；39.02；38.21；34.7；29.01；24.54；21.93(图11)。
实施例5N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮-半抗原B的制备在去甲氯胺酮4(2.5g，0.011mol)50ml无水乙醇溶液中加入三乙胺，TEA，(2ml)和乙酸碘代丙基硫酯(2.95g，0.0121mol)。混合物搅拌回流48小时(TLC显示反应完成)。蒸发溶液至干，通过在硅胶(60％己烷/40％乙酸乙酯)上层析纯化残留物，获得1.8g(48％)的N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮(半抗原B)的亮黄色油形式。
IR(薄膜)3354.33；3063.62；2937.2；2863.86；1692.95(br)和757.97。
NMR13C(CDCl3)209.27；196.51；138.84；134.11；131.6；129.52；129.04；127.06；70.21；41.2；39.83；39.6；30.99；30.92；28.22；27.15和22.2(图12)。
实施例6N-(3′-乙酰基硫代丙酰胺基)去甲氯胺酮-半抗原C的制备向溶于10ml无水DMF的去甲氯胺酮4(2.5g，0.011mol)溶液中，在氮气条件下加入3-乙酰基硫代丙酸(1.79g，0.012mol)，EDC盐酸盐(2.53g，0.013mol)和吡啶(1.9g，0.024mol)。然后，在室温下搅拌该混合物2小时(TLC表明反应中没有起始物质)。将混合物蒸发至干，在硅胶(50％己烷/50％乙酸乙酯)上快速层析纯化粗制产物，得到2.3g(62％)的N-(3′-乙酰基硫代丙酰胺基)去甲氯胺酮(半抗原C)的黄色油形式。
IR(薄膜)3353.79；3066.59；2944.2；2867.78；1736.06；1682(br)和760.16。
实施例7半抗原A与BSA的结合-免疫原A将在水(0.5ml)中溶解104mg的EDC盐酸盐，立即加入到溶于DMF(1ml)的半抗原A溶液(70mg，0.22mmol)中。在混合后，将这一溶液加入到溶于10ml水的BSA(200mg)溶液中。立即加入Sulfo-NHS(52mg)，在室温下搅拌过夜温育反应混合物。然后，用磷酸缓冲盐水溶液(PBS)，pH7.2透析混合物24小时(换液3次)，冷冻干燥。
根据MALDI-TOF(参见附图6)，出现的信号表明，这一样品的平均质子化质量是m/z 69,227。这些数据表明，每分子BSA已经结合了平均9.7个分子的半抗原A。
实施例8溴代乙酰基甘氨酸修饰小牛血清白蛋白的制备向BSA(1g)的0.1M硼酸缓冲液(pH8.5，45ml)中，冷却到0℃滴加溶于DMF(5ml)的N-琥珀酰亚胺溴乙酰基甘氨酸(0.375g，0.13mmole)。在滴加过程中，维持pH为8.0，在0℃搅拌溶液1小时。调节pH到7，在4℃下用蒸馏水透析该溶液24小时(换液3次)。冷冻干燥该溶液得到990mg溴乙酰基甘氨酸修饰的BSA。
根据MALDI-TOF(参见附图7)，出现主要信号表明，这一样品的平均质子化质量为m/z 73,264。在m/z 36,644的信号是与双电荷形式的主要成分一致。这些数据表明，溴乙酰基甘氨酸修饰了平均38.6个赖氨酸基团。
实施例9半抗原B与溴乙酰基甘氨酸修饰BSA的结合-免疫原B将半抗原B(70mg)溶解于0.12M碳酸钾的80％甲醇/20％水溶液中(1ml)。然后，在氮气下放置混合物10到15分钟(TLC表明没有半抗原B，形成新的化合物具更低的Rf)。加入磷酸盐缓冲液(1ml-pH7)终止反应，加入几滴0.5M盐酸，将pH调节到7。逐滴将该溶液加入修饰的BSA溶液(200mg溶于10毫升水)中，在4℃搅拌过夜(避光保护)。用蒸馏水透析溶液24小时(换液3次)，冷冻干燥。
根据MALDI-TOF(参见附图8)，存在的主要信号表明，这一样品的平均质子化质量m/z是75,860。信号m/z38,077是与双电荷形式的主要成分一致。这些数据表明，平均8.8个分子的半抗原B结合到一个溴乙酰基甘氨酸修饰的BSA上。
实施例10半抗原C与溴乙酰基甘氨酸修饰BSA的结合-免疫原C用与半抗原B相同的方法(实施例9)，将半抗原C与溴乙酰基甘氨酸修饰的BSA结合。
根据MALDI-TOF(参见附图9)，存在的信号表明，这一样品的平均质子化质量m/z 76,424。信号m/z 38,050与双电荷形式的主要成分一致。这些数据表明，平均10.2个半抗原C分子结合一个溴乙酰基甘氨酸修饰的BSA。
实施例11半抗原A与HRP的结合-偶联物A将10mg的EDC盐酸盐溶解于800μl的水中，立即加入到溶于200μlDMF中的2mg半抗原A溶液中。混合后，将这一溶液加入溶于1ml水的HRP(20mg)中。立即加入Sulfo-NHS(5mg)，在黑暗中室温下，温育反应混合物过夜。通过用pH7.2 PBS预平衡的2PD-10柱(Pharmacia)系列进行脱盐除去过量的半抗原。然后用10L PBS(pH7.2)4℃时透析半抗原-HRP偶联物过夜实施例12溴乙酰基甘氨酸修饰HRP的制备用实施例8描述的相同方法，进行溴乙酰基甘氨酸修饰HRP的制备。
实施例13半抗原B与溴乙酰基甘氨酸修饰HRP的结合-偶联物B将10mg半抗原B溶于0.5ml的0.12M碳酸钾溶液(80％甲醇/20％水)。在室温下维持得到的溶液10分钟。向溶液中加入1ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH7)终止反应，用0.5M盐酸调节pH到7-7.5。逐滴将500μl该溶液加入实施例12的溴乙酰基甘氨酸修饰HRP溶液(20mg溶于1ml水中)中，在黑暗中4℃下搅拌混合物过夜。然后，利用两个PD-10柱(Pharmacia生物技术公司)纯化半抗原-HRP偶联物，用PBS(pH7.2)洗脱，用10L水透析过夜。
实施例14半抗原C与溴乙酰基甘氨酸修饰HRP的结合-偶联物C用实施例13中半抗原B所用的同样方法将半抗原C与溴乙酰基甘氨酸修饰的HRP结合。
实施例15实施例10中制备的免疫原C的抗体的制备用弗氏完全佐剂(FCA)配制实施例10中制备的免疫原的水溶液，形成溶于50％(v/v)FCA中4mg/ml免疫原的乳液。用这一乳液免疫接种三只绵羊(1次免疫接种)，在每个动物侧腹4个位置各进行0.25ml的皮下注射。第二次免疫接种(加强1)含有2mg/ml免疫原，随后免疫接种(第2次到11次)含有1mg/ml免疫原。在50％(v/v)弗氏不完全佐剂(FIA)中乳化所有的加强液，并且以和第一次免疫接种相同的方法注射，一个月一间隔连续一年。每次加强免疫接种后7到14天进行血液取样。处理每个样品得到抗血清，进一步用辛酸和硫酸沉淀纯化得到免疫球蛋白G(IgG)组分。通过竞争性ELISA微量滴定板测试评估IgG组分，如下面实施例16所述。
实施例16氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性ELISA的研制用免疫原C(半抗原C-BSA)(实施例10)产生的抗血清IgG包被加强结合的96孔聚丙烯微量滴定板，在10mM Tris(pH8.5)中稀释(125ul/孔)。用标准ELISA检测板技术(checkerboard techniques)确定适当的包被抗体稀释倍数。在37℃温育平板2小时，用含有吐温20的Tris缓冲盐水(TBST)洗涤4次，轻敲干燥。制备0，0.1，0.5，1.5，25，100和500ng/ml的氯胺酮和去甲氯胺酮在TBST中的标准溶液，并将50μl每个浓度的标准液加入到合适的孔(附图4)。将在含有EDTA、D-甘露醇、蔗糖、乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal)和BSA的Tris缓冲液(pH7.2)中稀释的75μl的偶联物(半抗原A-HRP)(实施例11)加入到各个孔中，如附图4所示。也利用标准ELISA检测板技术测定合适稀释的偶联物。在37℃温育平板2小时。在10分钟内用TBST洗涤6次除去过量、未结合的偶联物。
在平板的每个孔中加入125μl的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，然后在黑暗中，在室温下温育15到20分钟。每个孔中加入125μl 0.2M H2SO4终止反应。然后，利用微量滴定板读数器测量450nm处吸光值。试验数据见下表1。
表1氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性微量滴定板试验产生的数据，利用了针对免疫原C(半抗原C-BSA)产生的抗血清(实施例10)和偶联物A(半抗原A-HRP)作为检测试剂(实施例11)。
A450＝450nm处的吸光值B＝450nm处，xng/ml标准浓度的吸光值
B0＝450nm处0ng/ml标准浓度的吸光值IC50＝产生50％B/B0的标准浓度％CR＝基于对氯胺酮的特异性的交叉反应百分数，这是本发明说明书中术语“交叉反应性”的含义。
实施例17氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性ELISA的交叉反应性为了确定氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性ELISA的特异性，制备溶于TBST中下面浓度的标准溶液0，0.1，0.5，1，5，25，100和500ng/ml。利用每个氯胺酮竞争性ELISA标准系列，绘制校准曲线，利用这些来确定这些物质的免疫测试交叉反应性。这一研究结果表示在表2中，根据下式计算潜在的交叉反应剂苯环利定和右甲吗喃的交叉反应性％CR＝IC50，氯胺酮/IC50，CR×100其中％CR是交叉反应性百分数，IC50，氯胺酮是导致信号50％置换的氯胺酮浓度，IC50，CR是导致信号50％置换的潜在交叉反应试剂的浓度。
表2氯胺酮和去甲氯胺酮的竞争性ELISA交叉反应性
IC50，CR＝导致50％信号置换的潜在交叉反应试剂的浓度％CR＝基于氯胺酮的特异性的交叉反应性百分数


本发明公开了在去甲氯胺酮的N位置或在羟基去甲氯胺酮或羟基氯胺酮的0位置用交联剂衍生的半抗原。本发明也提供了包括所述半抗原与产生抗原性的载体物质结合的免疫原，以及抗所述半抗原的抗体。另外，本发明涉及包括所述半抗原与可检测的标记试剂共价结合的半抗原偶联物。本发明也提供了利用了本发明的偶联物和抗体检测或测定氯胺酮和它的初级代谢物，去甲氯胺酮的方法和试剂盒。