专利名称：特定寡糖对nfk-b介导的病毒复制的抑制的制作方法特定寡糖对NFK-B介导的病毒复制的抑制技术领域本发明属于病毒复制领域，用于治疗NFK-B介导的病毒感染，特别是HIV感染。肠源细菌产物(例如脂多糖(LPS)和肽聚糖(PG))促进高度免疫活化，导致HIV-I 感染的疾病程度增加。这种高度免疫活化的原因可能是慢性LPS或PG诱导的Toll样受体 (TLR)介导的NF-κ B活化，导致HIV-I复制增加。果胶水解产物(pAOS)中的食用酸性寡糖已显示可抑制细菌性病原体在胃肠道中的附着。WO 2009/0976772 (图1半乳糖醛酸寡糖的链长对NFK B抑制的影响。对于聚半乳糖醛酸寡糖的抑制， 需要2个半乳糖醛酸基团的最小链长。用包含至少3个半乳糖醛酸基团的寡糖可获得最佳效果。图2在用AOS孵育22. 5小时并且用NAC(A)或L-半胱氨酸⑶与TNF-α孵育 2. 5小时后，ΗΕΚ293细胞中的NF κ B响应。在对NAC或半胱氨酸的影响进行校正后，获得C 曲线和D曲线，表明所述组分是严格累加性的。
图3不同NAC和AOS浓度下的谷胱甘肽浓度。所述结合物的影响大于单独组分对整个曲线的影响。在这些附图中，“AOS”代表pAOS。

⑶4+T细胞计数是AIDS进展的良好指示物，因为HIV主要感染⑶4+辅助T细胞， 最终导致细胞死亡。慢性的免疫过度活化——进行性HIV疾病中的一种典型特征——在进行中的 CD4+T 细胞去除中起重要作用。Brenchley et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 2006 ； 12 1365-1371.已经提出了肠在HIV诱导的慢性免疫活化中的重要作用。肠渗透性增加在HIV 感染的患者中较常见并导致微生物产物的易位。循环的脂多糖(LPQ——一种微生物易位的可靠标记物——已被证明在HIV感染患者中显著增加，这与免疫过度活化一致。而且，LPS水平在用HAART治疗时降低。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组分并因此是一种强效的免疫激发产物。这些发现表明HIV感染导致肠屏障功能受损，继而导致微生物易位增加， 最终促进慢性免疫活化。HIV复制似乎在维持这种受损的肠屏障功能时起重要作用。HIV感染时肠渗透性的原因尚未被完全理解，但是其可能是由于⑶4+T细胞感染。 胃肠道可能是体内最大的淋巴器官，占T细胞总载量的至少一半。由于CD4+T细胞在胃肠道中最丰富，因此HIV感染在肠内形成一个促炎症环境。推测此环境导致胃肠粘膜屏障损坏，从而增加微生物易位。这些细菌产物(如脂多糖和肽聚糖(PG))通过与TLR受体结合而诱导炎症应答，这不但诱导炎症，而且触发HIV病毒进行复制。所释放的HIV颗粒感染其他 ⑶4+T细胞，其形成甚至更大的促炎症环境并增加肠渗透性。此正向反馈环路驱动慢性免疫活化。不囿于理论，本发明人推测通过LPS诱导的或者PG诱导的Toll样受体(TLR)活化介导免疫过度活化。每种Toll样受体子集均被特定微生物产物所激发；LPS激发TLR-4，而PG 激发TLR-2。TLR的活化诱导信号传导通路，从而活化NF-κ B，导致炎症。NF-κ B是由转录因子的Rel/κ B家族的两种蛋白组成的二聚体，所述两种蛋白均为DNA结合所需。NF-K B组成型表达，但在未激发细胞的细胞质中以与I κ B抑制物蛋白的无活性复合体的形式存在。 当NF- κ B从其与I κ B的复合体中释放时，它能自由易位至细胞核，并在那里作为转录因子发挥作用。NF-K B的磷酸化增加了核定位、蛋白-蛋白相互作用和转录活性。当白细胞被 HIV-I感染时，NF-κ B至细胞核的易位在病毒复制中还起其他作用。NF-K B识别HIV-I的长末端重复序列(LTR)中具有连续序列5，-GGGPuNNPuPuCC-3，的两个IObp DNA片段。在瞬时转染研究中，任一 κ B位点的突变均导致LTR启动子活性的剧烈降低，表明NF- κ B在 HIV复制中起重要作用。由于NF-K B的该作用，NF-κΒ是治疗HIV感染个体的潜在靶标。 实际上，已发现抑制NF- κ B活化在体外降低了 HIV-I的复制(参见实施例)，并可因此可能会在体内推迟AIDS发展。据推测如实施例1中提及的特定营养寡糖的主要作用位点为肠。实施例1显示对一大组食用纤维进行了 NF-K B抑制能力的测试。已发现只有包含酸性寡糖(显示为果胶(以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式))、来自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、来自面包酵母的β -葡聚糖、D-核糖的少数选择能够在所述测试系统中抑制NF-K B。对于HIV感染，已知所述肠在急性和慢性感染期中在相关CD4+T白细胞中具有高水平的病毒复制。还已知所述肠被看作是常规抗反转录病毒疗法难以到达的独立区室(例如血液病毒水平可以抗反转录病毒疗法来降低，但不影响肠中的病毒载量)。推定的食用寡糖调节NF-K B活化的不同通路——这导致病毒产生特别是肠中病毒产生的减少——的能力使得食用寡糖在HIV感染治疗中具有潜在有益作用。食用寡糖可导致肠内病毒载量减少，这可全身性地表现为病毒载量的减少或CD4计数的增加或者两者的结合。由于上述推理，用NF- κ B抑制物(例如AOS和/或NAC)进行的治疗并不直接改变患者外周血液中的病毒载量。这可为肠的区室化所解释，在肠中这些营养组分似乎具有其最强的作用。抗病毒药物靶向抗反转录病毒疗法难以到达的区室的推定特性也表明使用这些特定寡糖可能与现有的抗病毒疗法特别是与抗反转录病毒疗法(HAART)具有协同效应。由于本发明寡糖的NF-K B抑制活性，本发明的优选组合物包含抗病毒疗法(例如HAART)与本发明组合
5物的结合物。为治疗HIV，所述权利要求的组合物可以与以下物质结合使用抗病毒疫苗， 抗病毒药物如奥司他韦(oseltamivir ；Tamiflu)、扎那米韦(zanamivir ；Relenza)等，或者用于治疗AIDS的抗反转录病毒治疗剂例如核苷和核苷酸反转录酶抑制剂(nRTI)、非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂如雷特格韦(Raltegravir)、 进入抑制剂(或融合抑制剂)如马拉维若(Maraviroc)和恩夫韦地(Enfuvirtide)或者突变抑制剂如贝韦立马(Bevirimat)和Vivecon。组合物本发明组合物优选地包含糖醛酸寡糖和/或糖醛酸多糖，优选寡聚半乳糖醛酸和 /或聚半乳糖醛酸。最优选地，这些是果胶水解产物，在本领域中通常被认为是果胶酸性寡糖(pAOS)。最优选地，果胶(水解产物)以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式存在或包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸。糖醛酸寡糖(优选果胶水解产物)优选地通过以果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸内切酶和/或果胶酶对果胶的酶法消化获得。在本发明上下文中，术语“寡聚糖醛酸”和“聚糖醛酸”可互换使用，并且寡聚糖醛酸和聚糖醛酸被理解为具有2-250的DP，更优选2-100的DP，甚至更优选2_50的DP，最优选2-20的DP。所述糖醛酸寡糖和糖醛酸多糖优选地是半乳糖醛酸寡糖和半乳糖醛酸多糖 (包括二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸)。最优选地，所述聚合度为平均DP。在一个实施方案中，所述组合物包含聚半乳糖醛酸。半胱氨酸或半胱氨酸来源本发明人发现N-乙酰半胱氨酸(NAC)也能够抑制NF- κ B活化。此抑制能力背后的机制尚不清楚，但已经推测其涉及NAC间接通过GSH水平恢复而降低氧化胁迫的能力。氧化胁迫已被证明通过一种仍有争论并很可能是细胞类型特异性的机制促进NF-κ B活化。 然而，大多数研究表明ROS诱导的NF- κ B活化倚赖于磷酸化IKK (间接通过PKD (蛋白激酶 D)活化)的经典通路。由于本发明人发现NAC和AOS可一起对NF- κ B活化起作用，因此推测NAC和AOS 对GSH水平具有累加效应。为确定这一点，将HEK293细胞用AOS孵育22. 5小时，并且用 NAC与TNF- α孵育2. 5小时。将获得的GSH水平针对细胞数进行校正，并将结果与TNF- α 激发细胞(对照)的水平相比较。IOmM浓度的NAC的加入增强了 GSH水平。在加入2和 3mg/l后，AOS能够显著增加GSH水平。NAC和AOS的组合使得GSH产生最高增加至对照的 278%。将数据集与其基线对照(0mg/ml AOS与其特定浓度的NAC或L-半胱氨酸)进行比较并示于实施例2中。AOS和NAC的高浓度导致GSH水平相对更强的增加。据此，可得出 AOS和NAC对HEK293细胞中GSH的产生具有协同效应。所提供的组合物除包含一种或多种上述寡糖以外，还包含合适量的半胱氨酸和/ 或半胱氨酸源。短语“半胱氨酸源”在本文中是指含有任意形式的生物可利用的半胱氨酸的所有化合物，并且以化合物中存在的或者可在摄入后在体内从化合物产生的半胱氨酸氨基酸的量(以摩尔计)计算。下文中“半胱氨酸等价物”是指一份的半胱氨酸本身，或者是指半胱氨酸源中存在的一份的半胱氨酸。例如IOOmg NAC (N-乙酰半胱氨酸；丽=163. 2)等价于半胱氨酸 (MW 121.15)。因此IOOmgNAC是半胱氨酸等价物。这同样也适用于蛋白或肽。当肽(MW = χ道尔顿)含有3个半胱氨酸氨基酸(3y道尔顿)时，IOOmg该肽等价于100X3Y/X 半胱氨酸。因此IOOmg该肽为300y/x mg半胱氨酸等价物。本发明合适的半胱氨酸来源为，例如变性和/或非变性形式的蛋白，例如乳蛋白如乳清蛋白或酪蛋白。卵蛋白富含半胱氨酸并因此也是合适的。植物蛋白例如豌豆、马铃薯、大豆和稻也可用于提供半胱氨酸。也可使用这些蛋白来源的水解产物或者富含半胱氨酸的蛋白质或肽的富集组分(例如EP1201137中所述)。此外，还可使用合成的半胱氨酸等价物，例如半胱氨酸衍生物，如半胱氨酸、胱氨酸、半胱氨酸盐、N-乙酰半胱氨酸和/或二乙酰半胱氨酸。HIV感染的受试者适合被给予的每日剂量为至少约IOOmg的半胱氨酸等价物，优选每日至少约200、400或600mg半胱氨酸等价物，更优选每天至少约IOOOmg半胱氨酸等价物。应理解每日剂量可再分为一天服用数次的2、3或更多个剂量单位。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种激发谷胱甘肽水平的化合物。例如，硫辛酸、丙酮酸(pyruvate)、草酰乙酸(oxaloacetate)、草酰天冬氨酸盐 (oxaloaspartate)能够激发谷胱甘肽水平。这类激发谷胱甘肽水平的化合物可与半胱氨酸一起使用，也可替代半胱氨酸。ω-3多不饱和脂肪酸本发明人发现ω-3多不饱和脂肪酸也能够抑制NF-κ B活化。这在所附实施例中已证明，其中只展示了在这类多不饱和脂肪酸与AOS和半胱氨酸结合的情况下的效应。所提供的组合物优选地另外包含ω-3多不饱和脂肪酸。本发明的用于治疗的不饱和脂肪酸优选地选自(18-以6 -3多不饱和脂肪酸。优选的ω-3多不饱和脂肪酸包括二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳四烯酸(ETA)和二十二碳五烯酸(DPA)，最优选至少包括EPA和/或DHA。在用于所述寡糖测试的相同体外模型中，EPA显示出NF κ B抑制作用。C20-(^6 ω -3不饱和脂肪酸的每日剂量可为200mg-2000g。实施例实施例1寡糖NF κ -B抑制活性的筛查


本发明人出乎意料地发现特定寡糖能够通过抑制NF-κB活化而抑制病毒复制。本发明因此涉及一种用于抑制患有病毒性疾病的哺乳动物中的病毒复制的组合物，所述组合物包含果胶(以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式)、来自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、来自面包酵母的β-葡聚糖、D-核糖或其混合物。

公开日2012年5月30日 申请日期2010年6月21日 优先权日2009年6月19日