专利名称：用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法 血红蛋白作为血液中的天然氧气运输成分，是目前制备红细胞代用品的主要目标。现已了解，血红蛋白是一种由四个亚基组成的四聚体形式的结构，其中包括了两个α亚基和两个β亚基，每个亚基有一个球蛋白肽链，四聚体物的分子量约为64,000道尔顿，其中每个亚基的分子量相近。研究发现，四聚体的血红蛋白脱离了红细胞后极易离解为αβ二聚体，在某些情况下，甚至还会进一步离解为α亚基和β亚基的单体。由于离解后的血红蛋白分子量太小，使其不能在身体的循环系统内保留而迅速被肾脏过滤，随尿排出体外。因其半衰期太短，且易引起肾损伤，故达不到作为红细胞代用品的作用。另外，由于未交联聚合的血红蛋白分子能穿过血管壁而与血管舒张因子NO结合，导致血管收缩，使血压升高。因此，使上述血红蛋白亚单位之间和在两个和多个四聚体之间进行交联聚合，使之形成分子量大于64,000道尔顿的血红蛋白寡聚物和多聚物，以延长其半衰期，并消除肾毒性等副作用是非常必要的。文献报导显示，科学家们已为此进行了大量的研究工作，以期制备出一种令人满意的以血红蛋白为基础、并能克服血红蛋白在血红细胞之外在化学性质上的不利因素的红细胞代用品。在使血红蛋白分子进行交联聚合，形成分子量大于64,000道尔顿的血红蛋白寡聚物和多聚物的过程中，这些工作的目的主要是寻找适当的交联剂，以及适当的反应条件。在交联剂的选择中，目前一般多是以开环棉子糖、三糖棉子糖等糖类，或是以戊二醛为交联剂。在采用糖类化合物作为交联剂的方法中，如，4,857,636号的美国专利文献提出了一种以糖类作为交联剂，在20∶1摩尔比的条件下进行反应，对得到稳定的联分子是有益的。第5,770,727号美国专利报导了采用开环棉子糖为交联剂的方法，在pH5.0-7.0的缓冲体系下，以交联剂与血红蛋白摩尔比为1～4∶1反应24小时，得到的交联血红蛋白中四聚体的含量为40％，二聚体含量小于5％。公开号为CN 1105800A的中国专利文献报导了一种以由环开放氧化的双/三糖如棉子糖为交联剂，在pH5.0-7.0的条件下，以摩尔比为1∶1～4∶1的bis-tris缓冲体系中反应，所得的交联产物中无大于600K道尔顿的分子，脱氧血红蛋白含量在1％-15％。由于以糖类化合物为交联剂进行反应时，血红蛋白易发生分子内的交联，因此所得交联产物中的四聚体等不需要的小分子血红蛋白的比例较大，因此，在交联反应中使用较多的另一种交联剂是戊二醛。在采用戊二醛为交联剂的方法中，第5,194,590号和第6,323,320号美国专利采用的反应体系均为pH8.0的偏碱性，底物的血红蛋白的浓度为14-15克/100毫升，以戊二醛为血红蛋白分子摩尔比14.8-18.1倍的方式反应3.5-4小时，可得到70％的聚合物，反应7小时的聚合转化率可达80-90％，但高分子部分的量显著增加；第5,753,616号美国专利报导了以巯基化合物作为稳定剂，底物血红蛋白浓度为40克/升，在pH7.6-7.9的条件下，以交联剂为血红蛋白20-40倍摩尔比和42℃条件下反应5小时；第5,895,810号美国专利报导了一种采用类似方式的制备方法。试验发现，交联反应中生成的超大分子，例如分子量＞600,000道尔顿的交联产物，对于后期的纯化、终产品的粘度、稳定性等均有极为不利的影响。现已有试验结果显示，在采用戊二醛为交联剂的方法中，影响交联反应，尤其是影响其交联反应产物分子量分布的不均匀、以及超大分子量产物形成的因素较多，例如，仅反应环境的pH高低就可以有较大的影响，特别是在偏碱性的反应环境中，由于易使血红蛋白分子中的胺基的活性过高，是形成超大分子产物的重要原因之一。
针对上述情况，本发明提供的是一种以戊二醛为交联剂使血红蛋白进行交联反应，以制备可用作红细胞代用品的交联聚合血红蛋白的更为理想的方法。该方法能在更为简化的反应条件和缩短反应时间的前提下，制备出对高铁血红蛋白的控制较好，交联产物的分子量分布也更为满意的交联聚合血红蛋白。本发明用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法，采用的是以戊二醛为交联剂对血红蛋白的水溶液进行处理。具体处理方法，是使已作脱氧处理后的血红蛋白溶液在pH6.0-7.5，以及混合有为血红蛋白分子1-10倍摩尔比的多氨基化合物作为交联竞争抑制剂的条件下，以充分分散的形式加入为血红蛋白分子7-14倍摩尔比的戊二醛反应，反应完毕再次加入多于为封闭残留戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂后，按常规方式进行还原剂反应并作常规过滤和超滤后，即得到分子量分布合适的交联血红蛋白溶液。其中，作为反应底物的血红蛋白溶液的重量/体积浓度一般可以在8％-14％的范围内。在本发明的上述方法中，可以作为原料使用的血红蛋白，虽并不排除如上述文献所报导的使用由牛血细胞分离得到的牛血红蛋白，但为避免如疯牛病等人与动物间可能发生的一些交叉感染性疾病，以及避免因异源性蛋白可能带来的免疫问题和随外源性基因而可能引发的更深层次的问题，特别建议的是采用人血红蛋白，其中可以包括由人的外周血和/或胎盘血中分离得到的人血红蛋白。在按本发明方法进行交联反应时，所用的血红蛋白溶液，既可以是由人红细胞中直接分离并经纯化的天然人血红蛋白溶液，也可以是按常规方式以5-磷酸吡哆醛对该血红蛋白又进行了PLP修饰所得到的吡哆醛血红蛋白溶液。如上述，戊二醛为交联剂对血红蛋白进行交联反应时，反应环境的pH对交联反应有明显的影响。例如，以血红蛋白溶液的浓度为12％(w/v)和戊二醛与血红蛋白分子的摩尔比为20∶1的同样条件下，使上述的交联反应分别在pH＝7.30和pH＝6.80的不同反应体系中进行的试验结果显示，以高压液相对两者的反应产物进行检测发现，前者产物中分子量＞60万D(道尔顿)的交联血红蛋白的比例可达33.9％，后者的则只有23.9％。因此本发明方法将交联反应的条件控制在中性偏酸、弱酸性及中性生理条件的环境，即在pH＝6.0-7.5的范围内进行，而不是碱性的条件，是使交联反应产物中＞60万D部分的交联血红蛋白的比例能得到满意控制的一个重要因素。
试验结果还显示，在上述方法的基础上，如能适应随交联反应的进行，反应底物逐渐减少和反应产物逐渐增多的反应进程的变化，进一步将对反应环境条件pH的控制方式采用由低向高逐步调节的形式，即使反应条件中的pH6.0-7.5采用在加入戊二醛之前为pH＝6.0-6.5；加入戊二醛以后，再使反应溶液的pH渐升高至7.0-7.5的形式。这样，可以在使超大分子产物的生成得到有效的控制，并提高交联反应的转化率方面能产生更为理想的效果。例如，采取这种调节pH形式时较为简单的方式之一，是采取分段方式调节pH，即在加入戊二醛之前先将反应溶液调节成pH＝6.0-6.5；自戊二醛的加入后期起，再将pH调至7.0-7.5。这里所说的戊二醛的加入后期，则既可以是在戊二醛的加入后期随戊二醛的加入同时进行pH的调节，也可以是在戊二醛全部加入后，再进行第二次的pH调节。
以戊二醛为交联剂进行的上述交联反应如能在无氧环境中进行，对于控制产物中高铁血红蛋白成分的比例是有利的。基于同一目的，进一步，还可以使上述与戊二醛进行交联反应前的含脱氧血红蛋白的溶液中还加入有医学上可以接受的抗氧剂，例如常用的维生素C、葡萄糖中的至少一种；或是采用如半胱氨酸、谷胱甘肽等目前已有报导使用的适当形式的巯基化合物等抗氧剂，对于保证反应物中血红蛋白的脱氧状态，防止高铁产物的生成将会更为有利。上述对血红蛋白溶液pH的调节，同样也可以采用维生素C，并且还可以因此而具有一举两得的效果。
在上述方法中所说的对血红蛋白溶液进行的脱氧处理，一般可以采用目前已有采用的常用脱氧方法。例如，可以采用在真空条件下使被处理的血红蛋白溶液释放其所含的氧的方法，或者是采用向被处理的血红蛋白溶液中通入无氧的氮气和/或其它惰性气体将氧携带走等方法。试验表明，如能将此两种或多种方法以适当的方式联合使用，脱氧的效果会更为理想。
试验结果表明，在血红蛋白与戊二醛交联剂进行交联反应之前，预先向血红蛋白溶液中加入多氨基化合物形式的交联竞争抑制剂，可以有效地减少和避免在交联反应中超大分子产物大量生成，是本发明方法中控制超大分子产物比例和保证产物分子量分布均匀的又一重要和有效的措施。例如，在反应底物的血红蛋白浓度为8.0％、戊二醛与血红蛋白分子摩尔比为14∶1的同样情况下，未加入任何交联抑制剂进行交联反应后，＞60万D部分的交联血红蛋白比例可高达46.％；而在血红蛋白溶液中预先加入了为血红蛋白5倍摩尔比的量的赖氨酸后，再加入戊二醛进行交联反应，则产物中＞60万D部分的交联血红蛋白比例则可降低至13.7％，差别十分显著。可在本发明上述方法中作为交联竞争抑制剂的多氨基化合物，一般可以采用乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等醇胺类化合物，或者是如甘氨酸、赖氨酸、精氨酸等多种中性氨基酸中的至少一种。据研究，由于血红蛋白的表面约有40个赖氨酸侧链氨基，以及四个链端氨基可以参与反应，其与戊二醛之间进行的交联反应，特别是在避免形成超大分子产物时较难控制，致使交联反应的终产物必然是一种非均一分子量的混合物形式。本发明的方法中，在血红蛋白与戊二醛进行的交联反应前，采取了预先加入适当量的多氨基化合物作为竞争性交联抑制剂，使其中所含的氨基在交联反应过程中可以与血红蛋白分子形成竞争，因而对于防止血红蛋白分子在交联反应中形成不需要的超大分子产物是极为有利的，并且已如上述及更多的试验结果所证实。
试验显示，上述所说加入的交联竞争抑制剂的量一般控制在血红蛋白分子1-10倍摩尔比的范围内即可。加入过多量的交联竞争抑制剂，虽有利于减少超大分子结构产物的形成，但有会影响所需的正常分子量部分的血红蛋白产物的收率，因此可根据反应环境、所用交联竞争抑制剂的种类等具体条件，由试验确定其适宜或最佳的使用量。
本发明的上述方法中，为防止血红蛋白分子在交联反应中形成超大分子产物，另一个同样应当注意的重要因素，是对交联剂的加入方式，即，应采取以充分分散的形式加入，尽量避免使在所加入的戊二醛交联剂的局部浓度过大。例如，试验结果显示，当采用血红蛋白浓度为4-5％、pH＝6.4和戊二醛与血红蛋白摩尔比为9-10∶1的同样反应条件下，采用常规表面滴加和采用充分分散的不同方式加入戊二醛时，前者产物中分子量＞60万D部分的比例有18.8％，后者则甚至可为零。为此，在可以采取的措施中，一方面可以通过控制所使用的戊二醛交联剂的浓度。例如，试验结果显示，一般将所使用的戊二醛交联剂的重量/体积浓度控制为0.5-5％范围内是适宜的。另一方面，是控制加入戊二醛方式和/或速度。同样由试验结果显示，在加入交联剂时，一般将戊二醛的加入速度控制在0.1-0.5毫升/分钟·100毫升范围内也是适宜的。再一方面是充分的搅拌。在化学反应中，充分搅拌的重要性是无庸置疑的。但应注意的是，由于此类反应中血红蛋白的特殊性，在防止和避免引起血红蛋白的变性等不利影响的前提下，充分的搅拌也是可以采取的措施之一。此外，在实现上述所说的以充分分散的形式加入交联剂时可以采用的具体加入方式和/或所使用的设备中，例如除可以采用前述文献中已有报导的采用半透膜形式的加料设备和方式，使戊二醛均匀进入并分散于反应物中的形式，还可以采用也能使物料以充分分散的形式被加入和混合的其它结构形式的加料设备和/或加料方式，例如可以采用具有砂芯结构的加料设备或可具有类似均匀分散作用和效果的其它加料装置。采用前述文献中半透膜形式的加料装置时，特别应注意防止其半透膜孔的易被堵塞，以及受挤压泵的反复挤压易引致血红蛋白变性的情况。试验结果证明，在加入交联剂时，如能将上述的两种或几种有助于充分分散和混合的加料形式相互配合使用，对于防止在交联反应中超大分子产物的形成将会有更为理想的效果。
上述方法中所说的在交联反应完毕后，再次加入多于封闭残留戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂，对于及时终止反应，防止超大分子产物的生成而言，又是另一个重要的措施。反应终点的控制，一般可以通过对反应进程随时进行的检测监控实现。当反应物中寡聚物结构形式血红蛋白的量达到所需的要求后，应尽快终止反应，此时可以向反应物中再次加入交联竞争抑制剂，将进行交联反应后的残留戊二醛分子中的活性醛基全部封闭。此时所加入的交联竞争抑制剂，既可以为与第一次加入的竞争抑制剂相同，也可以与第一次加入的不同。所说的加入多于封闭全部残留的戊二醛中的醛基所需量的竞争抑制剂的量，试验结果提示，一般可以采用为血红蛋白分子摩尔量的5-20倍。
血红蛋白与戊二醛进行的交联反应，根据化学反应的一般规律，提高反应温度将有利于提高反应速度，缩短反应时间。因此，在保持反应物中的血红蛋白分子和/或反应后的交联聚合血红蛋白产物的活性不变形和受影响的前提下，可以使交联反应在相对较高的温度下进行，例如采用文献中已有报导的40℃以上的温度。但是另一方面，反应温度的提高，同样也会导致不希望的高铁血红蛋白等成分的增加。试验结果显示，一般情况下，将交联反应控制在0℃-4℃的温度条件下进行，效果将是更令人满意的。而且，此时的交联反应一般都可以在2-5小时的时间内完成。
交联反应完毕并再次加入多于封闭残留戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂，并以还原剂使通过交联反应所形成的希夫碱中不稳定的双键还原为稳定的单键，是目前对血红蛋白进行交联处理后的一种常规操作。因而，可以采用以硼氢化钠或甲硼烷类化合物等为还原剂的常规方式进行还原反应。对还原反应后的产物，同样也可以按常规方式进行后续的过滤和超滤等后处理。
由于在采用以戊二醛为交联剂对血红蛋白进行的交联反应中，控制交联产物的分子量及其分布状态一直是一个难点。由于交联反应后的交联血红蛋白产物是一种非均一分子量的混合物形式，其中过低分子量产物的稳定性差，容易离解并造成肾毒性，且携氧效率低；过大分子量的产物又会使血液的粘度增加，不利于血液的流动，而且会沉积在血管内壁及肝、脾中。体外实验表明，分子量在13万D和60万D之间的中等分子量的交联血红蛋白产物的稳定性较好，携氧效率接近人的全血，有良好的临床应用价值和前景。大量试验结果显示，采用本发明上述的制备方法，除反应条件温和外，由于使交联反应控制在较低pH的条件下进行，显著降低了血红蛋白分子中的胺基的活性；同时又在交联反应的反应物中预先加入了竞争性的交联抑制剂，进一步减低了交联剂戊二醛对血红蛋白的反应活性，再通过调节反应温度和交联剂加入方式等多种措施的进一步配合，可以使血红蛋白产物的分子量分布达到使＞60万D部分的所占比例被严格控制在较为理想的5％范围内，交联反应前后的高铁产物可控制在5％以内，半饱和时氧的氧分压(P50)仅降低1-3毫米汞柱。
根据上述内容，在不背离本发明上述技术思想的情况下，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，对上述内容还可以作出多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1以按常规方式经5-磷酸吡哆醛进行PLP修饰后的吡哆醛血红蛋白溶液为原料，血红蛋白浓度为11.26％(w/v)，高铁血红蛋白含量为3.59％(w/w)，反应容器置4℃冰浴中，用10％C维生素溶液调节pH至6.70，此时血红蛋白的浓度为10.6％，体积约为755毫升。通入湿润的高纯度N20.5-1小时，使血红蛋白转化为脱氧血红蛋白，溶液中加入0.1％谷胱甘肽作为抗氧剂，并预加为血红蛋白摩尔量5倍的赖氨酸。在充分而温和的搅拌状态下，用恒流泵经砂芯加样装置以0.1毫升/分钟·100毫升的速度加入1％(w/v)的戊二醛溶液，戊二醛与血红蛋白分子的摩尔比为13∶1，分二次加入，第一次加入11份，反应～0.5小时后，再加入剩余量的戊二醛并继续反应～1小时，反应完毕。之后，加入血红蛋白分子摩尔比11倍量的赖氨酸溶液，反应2小时后，加入为血红蛋白分子摩尔比20倍的硼氢化钠溶液按常规方式进行还原反应。整个交联反应过程均以高压液相跟踪检测反应物中交联血红蛋白的分子量分布状况。反应产物经常规过滤和超滤处理，即得到所需要的交联血红蛋白溶液产品。经检测，所得产品的高铁血红蛋白为3.4％(w/w)，分子量＞60万D的超大分子部分占2.9％，分子量为12万D～60万D的占47.1％，其中四聚体血红蛋白的比例为30.8％，二聚体血红蛋白的比例为19.2％。
实施例2交联反应的操作方式同上例。其中，血红蛋白溶液为对血红蛋白经过纯化处理但未作PLP修饰的血红蛋白溶液650毫升，血红蛋白浓度为12％，用维生素C调节pH6.70。在4℃冰浴下用湿润N2流脱氧0.5-1小时。交联反应前加入2％的维生素C或谷胱甘肽，以及血红蛋白摩尔量5倍的甘氨酸或乙醇胺作为交联竞争抑制剂后，加入作脱氧处理后的1％戊二醛，加入量为血红蛋白摩尔量的15倍，加入速度为0.2毫升/分钟·100毫升，并不断搅拌。4小时后，用血红蛋白摩尔量11倍的赖氨酸作为终止剂，反应2小时。然后加入59毫升的1.56％硼氢化钠溶液进行还原反应4小时，进行常规过滤和超滤。高压液相检测的结果表明产物中分子量＞60万D的超大分子部分的交联血红蛋白占6.8％，分子量为12万D～60万D的占32.2％，其中四聚体血红蛋白的比例为21.4％，二聚体血红蛋白的比例为39.7％。
实施例3操作过程同实施例1。
以经过PLP修饰后的吡哆醛血红蛋白溶液为原料，血红蛋白浓度为8％，体积600毫升，用维生素C调节pH＝6.40。在预加为血红蛋白摩尔量2倍的精氨酸溶液后，加入浓度为1％的戊二醛52.5毫升，加入量为血红蛋白摩尔量的7倍。加入速度为0.3毫升/分钟·100毫升，反应30分钟。然后，用20％磷酸氢二钠调节pH＝6.90，并在再次预加4倍量的精氨酸溶液后，再加入3.5倍量的1％戊二醛26毫升，加入速度同前。第二次反应完后，再用同样的磷酸氢二钠调节pH＝7.40，并再加入4倍量的精氨酸溶液，然后第三次加入3.5倍量的同样戊二醛溶液，加入速度不变。整个反应过程中不断搅拌。第三次加完戊二醛并反应0.5小时后，加入血红蛋白摩尔量11倍的精氨酸终止反应，反应时间2小时。然后用1.56％硼氢化钠36毫升(20倍量)进行还原反应4小时后，进行过滤和超滤。通过S-300中效柱对所得产品的检测，结果显示产物中分子量＞60万D的超大分子部分的交联血红蛋白占5％，分子量为12万D～60万D的占36.9％，其中四聚体血红蛋白的比例为20％，二聚体血红蛋白的比例为38.1％。


用于红细胞代用品的交联血红蛋白的制备方法，是使已作脱氧处理后的血红蛋白溶液在pH6.0－7.5，以及混合有为血红蛋白分子1－10倍摩尔比的多氨基化合物作为交联竞争抑制剂的条件下，以充分分散的形式加入为血红蛋白分子7－14倍摩尔比的戊二醛反应，反应完毕再次加入多于封闭全部戊二醛的醛基所需量的竞争抑制剂后，按常规方式进行还原反应并作常规过滤和超滤后，即得到分子量分布合适的交联聚合血红蛋白溶液。