专利名称：泌酸调节肽类似物的制作方法泌酸调节肽(OXM)是一种37个氨基酸的肽激素，其与胰高血糖素样肽I (GLP-I)一起，与营养摄入成比例地自小肠的L细胞释放。它由胰高血糖素(Gcg)的29残基全长序列加上C末端上的8肽延伸所组成，是前胰高血糖素原的组织特异性可变剪接的结果。内源OXM在体内通过二肽基肽酶IV和其他肽酶快速降解。OXM的确切受体仍未得到鉴定。OXM在体外结合且充分活化GLP-I受体(GLP-IR)和胰高血糖素受体(GcgR)，在2种受体上具有相似效力。 OXM涉及食物摄入和体重的调节。OXM急性施用于正常体重的人受试者降低饥饿且使进餐量减少19%。在对超重和肥胖受试者的4周研究中，OXM的每天3次餐前皮下施用产生了 2. 3kg的重量减轻，相对地，安慰剂组中的重量减轻为0. 5kg。在这个试验中，与基于GLP-I的治疗(例如依泽那太(exenatide)和利拉鲁肽(Iiraglutide))相关的最常见副作用一一恶心一显著地不太普遍。OXM通过在超重和肥胖人中促进增加的体力活动而增加了能量使用，尽管该效应的机制并不明了。对于开发成为商业上可行的治疗剂，OXM存在几个挑战。如上所述，它在体内快速降解并且由于其小尺寸而发生快速地肾清除。因此，希望鉴定具有改善的代谢稳定性和降低的清除率的OXM肽类似物。此外，OXM固有的GcgR激动剂活性是负面影响血糖控制(glycemic control)的一个危险因素。因此，还希望优化设计用于治疗用途的OXM肽类似物的效力，而在GLP-IR和GcgR的活性之间维持合适的平衡。GLP-IR的活化负责促胰岛素效应，而GLP-IR和GcgR两者的活化可以在减重效应中起作用。因此，希望产生具有有力的促胰岛素活性且促进重量减轻的OXM肽类似物，从而使得它可以用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病和/或肥胖。具有氨基酸置换以促进稳定性和具有另外修饰(例如聚乙二醇化或脂质化)以减慢清除的 OXM 肽，公开于 WO 2008101017、W02006134340、W02007100535 和 Pocai 等人Diabetes 58:2258-2266，2009中。虽然这些OXM衍生的肽可能是超过野生型肽的潜在改善，但是在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠模型中达到相当大的重量减少所需的剂量典型地高于对于药物的商品化而言可以视为可行的剂量。例如，Pocai等人(2009)报道了在用1900nmol/kg ( 8mg/kg)每隔一天(QOD)给药13天后平均Ilg (""25% )的重量减轻。尽管有多种OXM肽及其类似物可得，但仍需要更有力、稳定、长效和充分耐受的OXM肽类似物,其具有已优化的GcgR/GLP-lR活性比,从而使得肽的效力和促胰岛素活性可以提供对糖尿病，优选2型糖尿病，和相关病症的有效治疗。也期望提供其OXM肽类似物，所述类似物提供有效治疗以减轻体重。因此，本发明寻求提供用于糖尿病和/或肥胖的有效疗法。
本发明包括具有氨基酸置换的OXM肽类似物，所述氨基酸置换被引入以优化代谢活性和调节相对的GcgR/GLP-lR活性，同时优化总体效力。此外，本发明的OXM肽类似物是在所选位置上聚乙二醇化的，以增强作用时间，从而允许频率较低的给药。本发明提供了包含如下氨基酸序列的泌酸调节肽类似物I510His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-VaL-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- 3035(Aib) -Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39 (SEQ ID NO 5)其中Xaa38 是 Cys、Cys-PEG 或不存在，Xaa39 是 Cys、Cys-PEG 或不存在，并且其中C末端氨基酸是任选酰胺化的。本发明提供了包含氨基酸序列的泌酸调节肽类似物I510His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Gly-Arq-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO 1).此外，本发明提供了包含氨基酸序列的泌酸调节肽类似物I510His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO 2)其中在位置38上的Cys残基是任选聚乙二醇化的，并且其中在位置39上的Cys残基是任选聚乙二醇化的，且在位置39上的Cys的羧基基团是任选酰胺化的。优选地，SEQ ID NO 2的OXM肽类似物在位置38的Cys残基或在位置39的Cys上或在两者上被聚乙二醇化，其中40kDa PEG分子共价连接到这些位置上的Cys残基的巯基基团。更优选地，泌酸调节肽类似物在位置38和位置39的每个Cys残基上都发生聚乙二醇化，其中20kDa PEG分子与在这些位置上的每个Cys残基的各巯基基团共价连接。任选地，在位置39上的Cys残基可以从SEQ ID NO :2中缺失，留下在位置38上的用于聚乙二醇化的单个位点。更优选的泌酸调节肽类似物包含氨基酸序列I510His-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(20kDa PEG)-Cys(20kDa PEG) (SEQ ID NO :3)其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是任选酰胺化的。最优选的泌酸调节肽类似物包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是酰胺化的。在本发明中使用的PEG分子可以是线性或分支的，并且优选是线性PEG分子。 本发明提供了包含如上定义的泌酸调节肽类似物和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。另外，本发明提供了包含如上定义的泌酸调节肽类似物，连同药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂和任选地其他治疗成分的药物组合物。此外，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗非胰岛素依赖性(2型)糖尿病的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。另外，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗胰岛素依赖性(I型)糖尿病的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。本发明包括在有需要的受试者中治疗肥胖的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。此外，本发明包括治疗有需要的受试者中的非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的如上定义的泌酸调节肽类似物。本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用作药物。另外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在非胰岛素依赖性糖尿病治疗中使用。此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在胰岛素依赖性糖尿病治疗中使用。此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物用于在肥胖治疗中使用。本发明包括如上定义的泌酸调节肽类似物用于在非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖治疗中使用。本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。另外，本发明包括如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗胰岛素依赖性糖尿病的药物中的用途。此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗肥胖的药物中的用途。此外，本发明提供了如上定义的泌酸调节肽类似物在制备用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖的药物中的用途。本发明的OXM肽类似物有效结合且活化GLP-I受体(GLP-IR)和胰高血糖素受体(GcgR)两者。还已发现本发明的OXM肽类似物对肽酶，特别是二肽基肽酶IV，的降解比天然人OXM更有抵抗力。因此，本发明的OXM肽类似物具有与天然人OXM比较改善的体内稳定性。根据本发明的多个实施方案能够在超重和肥胖受试者中引起食物摄入的减少。本发明的一个特别优点是，与基于GLP-I的治疗，例如依泽那太和利拉鲁肽，通常相关的副作用，例如恶心，的频率被减少或消除。本发明因此具有与基于GLP-I的治疗比较减少的副作用。本发明的OXM肽类似物还具有与野生型人OXM比较更好的重量减轻效应。根据本发明的一个实施方案，泌酸调节肽类似物在具有2型糖尿病和/或相关代谢紊乱的受试者上具有改善的葡萄糖耐量和脂质谱，并且比野生型人OXM更有效地实现这 一点。发明详述泌酸调节肽(OXM)是对hGLP-lR和hGcgR具有完全功效和平衡效力的弱共激动剂，其在稳定超表达相应受体的J1EK293细胞中分别具有约6. 7±2. 7nM和4. 1± I. 7nM的EC5tl值。天然人OXM的序列在下文给出His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala—Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ IDNO 4)其中在位置39上的Cys (PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO 3的OXM肽类似物是完全有效和有力的泌酸调节肽类似物，其针对hGcgR和hGLP-lR分别具有59. 9 ±4. 14nM和2.75±0. 55nM的EC5Q。因此，其中在位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO :3的OXM肽类似物具有平衡的体外功能活性，与hGcgR比较，其对hGLP-lR具有大 Tl倍的选择性。对于结合亲和力Ki，观察到相当的结果，其中与hGcgR比较，位置39上的Cys(PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO 3的OXM肽类似物对于hGLP-lR具有大28倍的选择性，Ki值分别为 73 土 23nM 和 2050 ± 70nM。一个或多个PEG分子与OXM肽类似物的特定残基的共价附着导致聚乙二醇化的OXM肽类似物，该聚乙二醇化的OXM肽类似物，当与非聚乙二醇化的OXM肽类似物比较时，具有延长的半衰期和降低的清除率，并且对GLP-IR的体外效力类似于天然人OXM的。考虑到OXM肽类似物的小尺寸以及PEG分子(一个或多个)的相对大尺寸，预期OXM肽类似物，一旦聚乙二醇化后，将由于空间位阻而丧失活性。然而，已发现，如果置于泌酸调节肽类似物的末端而不是中间，那么肽类似物的活性可以更大程度地保留。在序列中的几个置换可以增强效力，从而抵消由于聚乙二醇化而引起的效力丧失，同时维持对GLP-IR和GcgR的合适活性比。此外，已发现，在OXM肽类似物的C末端上2个PEG分子的存在比单个PEG更优选。本发明的序列含有用于20种天然存在的氨基酸的标准单字母或三字母代码。使用的其他代码如下定义Aib=Q氨基异丁酸PEG=聚乙二醇PEG20K=具有20，OOODa的平均分子量的PEG分子如本文使用的，术语“PEG”意指聚乙二醇分子。以其典型形式，PEG是具有末端羟基的线性聚合物且具有式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,其中n是约8至约4000。一般地，n不是离散值，而是构成一个在平均值周围具有近似高斯分布的范围。末端氢可以由封端基团例如烷基或烷醇基团置换。优选地，PEG具有至少一个羟基，更优选它是末端羟基。该羟基优选附着至接头部分，所述接头部分可以与肽反应以形成共价连接。本领域中存在PEG的众多衍生物。(参见例如，美国专利号=5,445,090 ;5，900，461 ;5，932，462 ;6，436，386 ；6，448，369 ;6，437，025 ;6，448，369 ;6，495，659 ;6，515，100 和 6，514，491 和 Zalipsky,S.Bioconjugate Chem. 6:150-165,1995)。与本发明的OXM肽共价连接的PEG分子可以是约10，000,20, 000,30, 000或40，000道尔顿平均分子量。PEG分子优选是18，000-22，000道尔顿。更优选地，它是19，000-21，000道尔顿。最优选地，它是20，000-21，000道尔顿。它甚至更加优选是约20，000道尔顿。聚乙二醇化试剂可以是线性或分支分子，并且可以单个地或串联地存在。本发明的聚乙二醇化OXM肽类似物优选具有附着至肽的C末端的串联PEG分子。PEG分子优选通过mPEG-20kDa马来酰亚胺(图I)或mPEG_20kDa碘乙酰胺(图2)，附着至位于肽C末端的2个半胱氨酸残基上。在图I和图2中，n是10至2500。优选地，n是350至600。更优选地，n是425至475。

本发明提供可以用于治疗糖尿病和/或肥胖的泌酸调节肽类似物。