调节性t细胞在治疗中的使用方法[0002]免疫系统是彼此相互作用并协作防御疾病和对抗已确立疾病的许多不同成员的复杂网络。在这些成员中起抑制免疫活化并从而维持免疫稳态和对自身抗原的耐受的功能的为调节性T细胞。[0003]本领域描述的调节性T细胞包括不同的细胞群，例如天然的调节性T细胞(nTreg)、1型调节性T细胞(Trl)和Th3细胞。[0004]尽管在数十年前已预想过调节性T细胞的治疗潜能，但已证明通过药物的体内(in vivo)给药的其有效的免疫调节活性的临床实施是有挑战的。过继调节性T细胞疗法是利用调节性T细胞的免疫抑制活性的引人注目的备选方案。在该方法中，将调节性T细胞从患者或健康供体中分离出来、富集、有时进一步离体(ex vivo)扩增,并重新输注到同一患者或同种异体受者中。[0005]其在治疗应用中的使用有问题的，因为它们仅以非常小的百分比(人外周血单核细胞的约1-5%)存在。因此，已开发了离体活化和扩增或诱导扩增调节性T细胞的方法用于某些疾病的治疗。所有这些方法旨在提供大量的调节性T细胞例如至少IO7-1O9个细胞以重新输注到有此需要的患者中。[0006]事实上，细胞疗法的一个信条依赖于:输注的细胞越多，疗效越好，如经典的药物化合物所见。由于输注的细胞对 于患者而言比化学化合物可能的毒性较低，故通常向患者施予大量细胞(IO8-1Oki个细胞)。[0007]施予大量细胞的另一个原因是大量的被输注细胞通常优选迁移到肝、脾和肺并以较低的方式迁移到可为身体的任何其它部分的目标位点。[0008]最后，关于调节性T细胞疗法，临床医师希望实现高的调节性T细胞:常规T细胞之比并且也出于这个原因从而施予患者高数量的细胞。
[0009]在临床试验中实施调节性T细胞疗法时，本发明人发现施予患者的如此高剂量的调节性T细胞并不如其本领域中认为地那样有效。
[0010]因此，有针对有此需要的患者更有效的调节性T细胞疗法的新方法的需要。


[0011]本发明的一个目标是用于治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施予所述患者治疗有效剂量的IO4-1O6个调节性T细胞。
[0012]本发明的一个目标是用于在治疗有此需要的患者中的炎性病况或自身免疫性病况中使用的调节性T细胞，或者调节性T细胞用于治疗有此需要的患者中的炎性病况或自身免疫性病况的用途，其中拟将治疗有效剂量的IO4-1O6个调节性T细胞施予所述患者。[0013]在本发明的一个实施方案中，所述调节性T细胞是自体的。
[0014]在本发明的另一个实施方案中，所述调节性T细胞是同种异体的。
[0015]在本发明的另一个实施方案中，所述调节性T细胞为多克隆的。
[0016]在本发明的另一个实施方案中，所述调节性T细胞为单克隆的。
[0017]在本发明的另一个实施方案中，所述调节性T细胞特异性针对单一抗原。在本发明的另一个实施方案中，所述调节性T细胞特异性针对多个抗原。在本发明的另一个实施方案中，所述待治疗患者患有自身免疫性疾病、炎性疾病、哮喘性或变态性病况、移植物抗宿主疾病或正经历移植。
[0018]定义
[0019]本文所用术语“抗原”是指本发明的细胞针对的蛋白、肽、脂类或糖脂化合物。在一个实施方案中，所述术语“抗原”可指合成来源的分子或天然来源的分子，其与目标抗原具有序列同源性，或与目标抗原具有结构同源性、或其组合。在一个实施方案中，所述抗原可为模拟抗原表位(mimetope)，其中“模拟抗原表位”为模拟天然抗原并具有免疫原性的氨基酸序列，其诱导具有与所述天然抗原诱导的抗体相同的生物活性的抗体。所述抗原的“片段”是指所述抗原的任何子集，如更短的肽或脂类。所述抗原的“变体”是指与完整抗原或其片段基本相似的分子。变体抗原可利用本领域众所周知的方法通过变体肽或脂类化合物的直接化学合成来方便地制备。
[0020]本文所用术语“患者”是指人类。
[0021]本文所用术语“ 有效量”是指足以导致有益的或所需的临床结果(例如临床病况的改善)的量。
[0022]本文所用术语“克隆”或“克隆群”是指来源于独特的分化细胞的一群分化的细胞。
[0023]本文所用术语“治疗”是指临床干预，企图改变待治疗受试对象的疾病的自然病程，并且可进行用于预防或在临床病理过程期间进行。所需效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、遏制、减少或抑制疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病进展速度、改善或缓和疾病状态、并引起缓解、维持缓解状态或改善预后。调节性T细胞治疗和调节性T细胞疗法在本文以相同的含义使用。
[0024]本文所用术语“同种异体细胞”是指从一名受试对象(供体)中分离出来并输注至另一名受试对象(受体或宿主)的细胞。
[0025]本文所用术语“自体细胞”是指分离并回输至同一受试对象(受体或宿主)的细胞。
[0026]本文所用术语“多克隆的”是指包含识别同一抗原的不同表位或不同抗原的不同表位的多个克隆的群体。
[0027]本文所用术语“单克隆的”是指包含来源于单个细胞并识别单一抗原的一个表位的单个克隆的群体。

[0028]本发明人出乎意料地观察到，低剂量的调节性T细胞对于治疗有此需要患者的病况是有效的，而细胞疗法的常规剂量却是无效的。
[0029]在不受理论限制的情况下，本发明人提示，对于治疗疾病，低剂量的调节性T细胞比高剂量更有效，因为低剂量的调节性T细胞会被生物体视作新出现的免疫应答，以积极的方式进展下去，获得充分的增殖和抑制作用。
[0030]本发明的一个目标是用于治疗有此需要的患者的调节性T细胞，或调节性T细胞在用于治疗有此需要的患者中的用途，其中将治疗有效剂量的IO4-1O6个调节性T细胞施予所述患者。
[0031]本发明的一个目标是用于治疗有此需要的患者的调节性T细胞，或调节性T细胞用于治疗有此需要的患者中的用途，其中将治疗有效剂量的I X 104-9.99X IO5个调节性T细胞施予所述患者。
[0032]本发明的一个目标是用于治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施予所述患者治疗有效剂量的IO4-1O6个调节性T细胞。[0033]本发明的一个目标是用于治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施予所述患者治疗有效剂量的IX 104-9.99 X IO5个调节性T细胞。
[0034]在一个实施方案中，所述患者为人并且待施予的调节性T细胞为人细胞。
[0035]在本发明的一个实施方案中，待在所述患者中施予的治疗有效剂量为
1X 105-9.99 X IO5个调节性T细胞。
[0036]在本发明的一个实施方案中，待在所述患者中施予的治疗有效剂量为IX 104、2X 104、3X 104、4X 104、5X 104、6X 104、7X 104、8X 104、9X 104、10X IO4 个调节性 T 细胞。
[0037]在本发明的另一个实施方案中，待在所述患者中施予的治疗有效剂量为1X105、
2X IO5,3 X IO5,4X IO5,5 X IO5,6 X IO5,7 X IO5,8 X IO5,9 X IO5,9.99 X IO5 个调节性 T 细胞。
[0038]本发明的另一个目标是用于治疗有此需要的患者的调节性T细胞，或调节性T细胞用于治疗有此需要的患者中的用途，其中将I X 104-3 X IO4个调节性细胞/kg施予所述患者。
[0039]本发明的另一个目标是用于治疗有此需要的患者的方法，所述方法包括施予所述患者I X 104-3X IO4个调节性细胞/kg的治疗有效剂量。
[0040]在本发明的一个实施方案中，待在所述患者中施予的治疗有效剂量为IX 104、
1.1XlO4U.2X104、l.3X104、l.4X104、1.5X 104、1.6X 104、1.7X 104、1.8X 104、1.9X 104、2X104、2.1X104、2.2X104、2.3X104、2.4X104、2.5 X 104、2.6 X 104、2.7X 104、2.8X 104、
2.9X104、3X104个调节性细胞/kg。
[0041]依据本发明，待施予所述患者的调节性T细胞为人调节性T细胞并包含⑶4+⑶25+调节性T细胞或FoxP3+调节性T细胞(天然Treg或常规Treg)、Trl细胞、分泌TGF-@的Th3细胞、调节性NKT细胞、调节性Y 6 T细胞、调节性CD8+T细胞、双阴性调节性T细胞、体外(in vitro)诱导的调节性T细胞或其混合物。
[0042]本文所用术语“Trl细胞”是指在静息时具有⑶4+⑶25-FoxP3-的表型并且在活化后能够分泌高水平的IL-10和中等水平的TGF-P的细胞。Trl细胞通过其独特的细胞因子谱来部分地表征:它们产生高水平的IL-10、中等水平的TGF-P和中等水平的IFN-Y，但几乎不产生或不产生IL-4或IL-2。典型地在用T淋巴细胞的多克隆活化物例如抗-⑶3+抗-CD28的抗体或白细胞介素-2、PMA+离子霉素(ionomycin)活化后的细胞培养物中对细胞因子的产生来进行评估。或者，在用由抗原呈递细胞所呈递的特异性T-细胞抗原活化后的细胞培养物中对细胞因子的产生来进行评估。高水平的IL-10对应于至少约500pg/ml，典型地大于约 1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000 或 20000pg/ml或更高。中等水平的TGF-P对应于至少约100pg/ml，典型地大于约200、300、400、600、800或1000pg/ml或更高。中等水平的IFN-Y对应于Opg/ml-至少400pg/ml的浓度,典型地大于约 600、800、1000、1200、1400、1600、1800 或 2000pg/ml 或更高。几乎没有或无 IL-4或IL-2对应于小于约500pg/ml，优选小于约250、100、75或50pg/ml或更低。
[0043]本文所用术语“天然的调节性T细胞”是指在静息时具有⑶4+⑶25+FoXP3+表型的细胞。
[0044]本文所用术语“Th3细胞”是指具有⑶4+FoXP3+的表型并且在活化后能够分泌高水平的TGF-P、低量的IL-4和IL-10且不能够分泌IFN- y或IL-2的细胞。这些细胞是TGF-P来源的。
[0045]本文所用术语“调节性NKT细胞”是指在静息时具有⑶161+⑶56+CD16+和V a 24/ IlTCR表型的细胞。
[0046]本文所用术语“调节性⑶8+T细胞”是指在静息时具有⑶8+⑶122+的表型并且在活化后能够分泌高水平IL-10的细胞。
[0047]本文所用术语“双阴性调节性T细胞”是指在静息时具有TCR a ^ +⑶4XD8—的表型的细胞。
[0048]本文所用术语“可体外诱导的调节性T细胞”是指在体外分化成调节性T细胞的初始 T 细胞(naive T cell)。
[0049]所述可体外诱导的调节性T细胞的一个实例为在TGF-P存在的情况下从初始T细胞分化而来的Th3细胞。另 一个实例是通过体外分化获得的天然的调节性T细胞或Trl细胞。
[0050]本文所用术语“ Y 6 T细胞”是指表达TCR的[Y ] [ S ]异源二聚体的T淋巴细胞。与[a ][0]T淋巴细胞不同，它们经由不依赖于由MHC分子呈递的机制识别非肽抗原。可描述Y S T细胞的两个群体:具有Vy 9V S 2受体的Y S T淋巴细胞，其代表外周血中的多数群体；和具有VS I受体的Y S T淋巴细胞，其代表黏膜中的多数群体并且在外周血中存在非常有限。V Y 9V S 2T淋巴细胞已知参与针对胞内病原体和血液系统疾病的免疫应答。
[0051]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为Trl细胞。
[0052]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为CD4+CD25+调节性T细胞或FoxP3+调节性T细胞(天然Treg)。
[0053]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为分泌TGF- ^的Th3细胞。
[0054]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为调节性NKT细胞。
[0055]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为自体调节性T细胞或同源异体调节性T细胞。
[0056]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞可为多克隆细胞群或单克隆细胞群。
[0057]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞可为一个抗原特异性的或多个抗原特异性的。
[0058]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为多个抗原特异性的天然的调节性T细胞。
[0059]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为一个抗原特异性的天然的调节性T细胞。
[0060]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为一个抗原特异性的Trl细胞。
[0061]在本发明的另一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞为多个抗原特异性的Trl细胞。
[0062]所述调节性T细胞可特异性针对的抗原的实例包括但不限于:自体抗原；来自普通人类饮食的食物抗原；炎症抗原例如多发性硬化症相关抗原或关节相关抗原；变应原和细菌抗原。
[0063]术语“来自普通人类饮食的食物抗原”是指来自人类普通食品的免疫原性肽，例如以下非限制性名单中的食物抗原:牛抗原，例如脂质运载蛋白(Iipocalin)、钙结合S100、a-乳清蛋白、乳球蛋白(例如P -乳球蛋白)、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可为大西洋鲑(atlantic salmon)抗原,例如小白蛋白(parvalbumin);鸡抗原,例如卵类粘蛋白(ovomucoid)、卵清蛋白、Ag22、伴白蛋白(conalbumin)、溶菌酶或鸡血清白蛋白；花生、虫下抗原，例如原肌球蛋白(tropomyosin);小麦抗原,例如凝集素(agglutinin)或麦醇溶蛋白(gliadin);芹菜抗原，例如芹菜抑丝蛋白(profilin);胡萝卜抗原，例如胡萝卜印丝蛋白；苹果抗原，例如甜蛋白(thaumatin)、苹果脂质转移蛋白、苹果抑丝蛋白；梨抗原，例如梨抑丝蛋白、异黄酮还原酶；鳄梨抗原，例如内切几丁质酶(endochitinase);杏抗原,例如杏脂质转移蛋白；桃抗原，例如桃脂质转移蛋白或桃抑丝蛋白；大豆抗原，例如HPS、大豆抑丝蛋白或(SAM22)PR-1O 蛋白。
[0064]术语“自体抗原” 是指从所述个体的蛋白质衍生的免疫原性肽。举例来说，其可为以下非限制性名单中的自体抗原:乙酰胆碱受体、肌动蛋白、腺嘌呤核苷酸转运体(adeninnucleotide translocator)、肾上腺素受体、芳香族L-氨基酸脱羧酶、脱唾液酸糖蛋白受体、杀菌/渗透性增强蛋白(BPi)、钙敏感受体、胆固醇侧链裂解酶、IV型胶原蛋白链、细胞色素P4502D6、结蛋白(desmin)、桥粒芯糖蛋白-1 (desmoglein-1)、桥粒芯糖蛋白_3、F-肌动蛋白、GM-神经节苷脂、谷氨酸脱羧酶、谷氨酸受体、H/K ATPase、17-羟化酶、21-羟化酶、IA-2(ICAS12)、胰岛素、胰岛素受体、I型内因子、白细胞功能抗原1、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein)、髓鞘喊性蛋白(myelin basic protein)、髓鞘少突胶质细胞蛋白(myelin oligodendrocyte protein)、肌球蛋白、P80-丝切蛋白(coilin)、丙酮酸脱氢酶复合物E2 (PDC-E2)、钠/碘同向转运体(sodium iodide symporter)、S0X-10、甲状腺和眼睛肌肉共用蛋白(thyroid and eye muscle shared protein)、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素受体、组织谷氨酰胺转胺酶、转录辅活化因子P75、色氨酸羟化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羟化酶、ACTH、氨酰基-tRNA-组氨酰合成酶、心磷脂(cardiolipin)、碳酸酐酶I1、着丝粒相关蛋白、DNA依赖性核小体刺激性ATPase、纤维蛋白(fibrillarin)、纤连蛋白(fibronectin)、葡萄糖-6-磷酸异构酶、0-2-糖蛋白1、高尔基体蛋白(golgin) (95、97、160、180)、热休克蛋白、半桥粒蛋白180、组蛋白H2A、组蛋白H2B、角蛋白、IgE受体、Ku_DNA蛋白激酶、Ku-核蛋白、La磷蛋白、髓过氧化物酶(myeloperoxydase)、蛋白酶3、RNA聚合酶1_111、信号识别蛋白、拓扑异构酶1、微管蛋白、波形蛋白(vimenscin)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudinll)、环核苷酸3’磷酸二酯酶(CNPase)、BP抗原I (BPAGl-e)、转醒醇酶(transaldolase) (TAL)、人类线粒体自体抗原 PDC-E2 (Novol 和 2)、0GDC-E2 (Novo3)和 BC0ADC-E2 (Novo4)、大疱性类天疱疮(BP) 180、层粘蛋白(Iaminin) 5 (LN5)、DEAD盒蛋白48 (DDX48)或胰岛素瘤相关抗原_2。
[0065]术语“多发性硬化症-相关抗原”是指髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MG)、髓鞘少突胶质细胞蛋白(M0G)、蛋白脂质蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白(0MGP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(M0BP)、少突胶质细胞特异性蛋白(0SP/Claudinll)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(0SP)、N0G0 A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22 (PMP22)、2’，3’ -环核苷酸3〃-磷酸二酯酶(CNPase)、其片段、变体和混合物。
[0066]术语“关节相关抗原”是指被瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白(filaggrin)肽、II型胶原蛋白肽、人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、异质核核糖核蛋白(heterogenousnuclear ribonucleoprotein) (hnRNP)A2 妝、hnRNP B1、hnRNP D、Ro60/52、HSP60、65、70和90、BiP、角蛋白、波形蛋白、纤维蛋白原、I型、III型、IV型和V型胶原蛋白肽、膜连蛋白V、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、乙酰钙蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脱氢酶(H)H)、醛缩酶、拓扑异构酶1、snRNP、PARP, Scl_70、Scl-100、磷脂抗原(包括阴离子性心磷脂和磷脂酰丝氨酸)、电中性磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱、基质金属蛋白酶、原纤维蛋白、聚集蛋白聚糖(aggreccan)。
[0067]术语“变应原”是指吸入性变应原、摄入性变应原或接触性变应原。变应原的实例包括但不限于源自花粉(Cup、Jun)、屋尘螨(Der、Gly、Tyr, L印)、狗、猫和啮齿动物(Can、Fel.Mus, Rat)的吸入性变应原。接触性变应原的实例包括但不限于重金属(例如镍、铬、金)、乳胶、半抗原例如氟烧(halothane)、肼屈嗪(hydralazine)。
[0068]细菌抗原的实例可包括荚膜抗原(例如，蛋白抗或多糖抗原例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)荚膜的CP5或CP8);细胞壁(包括外膜)抗原例如肽聚糖(例如粘肽、糖肽、胞壁质(mureins)、胞壁酸残基、葡萄糖胺残基)、多糖、磷壁酸(例如，核糖醇磷壁酸和甘油磷壁酸)、磷脂、草禾醇(hopanoids)、脂多糖(例如，细菌例如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)血清型011的脂A或0_多糖部分);质膜成分包括磷脂、草禾醇和蛋白；周质内存在的蛋白和肽聚糖；伞毛抗原、菌毛抗原、鞭毛抗原、和S层抗原。金黄色葡萄球菌抗原可为血清型5荚膜抗原、血清型8荚膜抗原，共同具有血清型5和8荚膜抗原的抗原、血清型336荚膜抗原、蛋白质A、凝固酶、凝聚因子A、凝集因子B、纤连蛋白结合蛋白、血纤蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似物蛋白、多糖胞内黏附分子、a -溶血素、(6-溶血素、S-溶血素、Y -溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、表皮剥脱毒素A、表皮剥脱毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂肪酶、葡激酶(staphylokinase)、LukDE杀白细胞素、肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1、聚-N-琥珀酰基3-1-6氨基葡糖胺、过氧化氢酶、^ -内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化作用抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi和血管假性血友病因子结合蛋白(von Willebrand factor binding protein)。
[0069]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞可从血液(例如外周血或脐带血)、或从组织活检(例如淋巴结活检、肠道活检或滑膜活检或黏膜组织活检)或从支气管肺泡灌洗液或脑脊液中获得。[0070]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的调节性T细胞包含在含药学上可接受的载体的药物组合物中。
[0071]本文中可用的药学上可接受的载体是常规载体。Remington’ s PharmaceuticalSciences第16版，Osol1A.编辑(1980)描述了适合本发明的组合物进行医药递送的组合物和制剂。总的来说，载体的性质将取决于所用的给药模式。举例来说，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为运载体，所述可注射流体包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、芝麻油、甘油、乙醇或其组合等。载体和组合物可为无菌的，且制剂适合于给药模式。除生物中性载体以外，欲施用的药物组合物还含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂、乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨聚糖酯。所述组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液。
[0072]在本发明的另一个实施方案中，可对包含所述调节性T细胞的组合物进行配制以用于肠胃外、肌内、组织内、静脉内或腹膜内注射、鼻内吸入、肺吸入、皮内或关节内注射。
[0073]优选地，本发明的药物或药物组合物的施予可通过肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射到患者的淋巴结内或直接注射到炎症部位内或直接注射到移植器官内，更优选地通过静脉内注射。
[0074]在本发明的一个实施方案中，所述待施予患者的包含调节性T细胞的组合物在袋/输液袋(pouch/infusion bag)或注射器中。
[0075]在本发明的一个实施方案中，所述袋/输液袋或所述注射器包含IOOii l-500ml的所述组合物。
[0076]在另一个实施方案中，所述袋/输液袋或所述注射器包含lOOiU-lOOml的所述组合物。
[0077]在另一个实施方案中，所述袋/输液袋或所述注射器包含100ia_50ml的所述组合物。
[0078]在另一个实施方案中，所述袋/输液袋或所述注射器包含lOOiU-lOml的所述组合物。
[0079]在另一个实施方案中，所述袋/输液袋或所述注射器包含100ia_5ml的所述组合物。
[0080]本发明的一个目标是医疗设备，例如包含如本文上述的治疗有效剂量的调节性T细胞、或包含如本文上述的治疗有效剂量的调节性T细胞的药物组合物的袋/输液袋或注射器。
[0081]在本发明的一个实施方案中，如本文上述的治疗有效剂量的调节性T细胞按每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施予患者。在另一个实施方案中，如本文上述的治疗有效剂量的调节性T细胞按每月一次、每两个月一次、每三月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次施予患者。
[0082]在另一个实施方案中，如本文上述的治疗有效剂量的调节性T细胞按每8周一次施予患者。
[0083]以下为用于获得自体调节性T细胞或同源异体调节性T细胞的方法的描述性实例。
[0084]一种用于获得人Trl细胞的方法，其包括:[0085]a)从受试对象中分离祖细胞群，
[0086]b)通过在IL-10存在的情况下培养所述祖细胞群获得树突细胞群，
[0087]c)使步骤b)的细胞与从所述受试对象中分离出来的CD4+T淋巴细胞群在抗原存在的情况下接触，以允许针对所述抗原的CD4+T细胞分化为Trl细胞群，和
[0088]d)回收来自步骤c)的Tr I细胞群。
[0089]在步骤b)中，IL-10在培养基中以50_250U/ml，优选地以100U/ml存在。用于获得 Trl 细胞的所述方法在 Wakkach 等(Immunity2003May; 18 (5): 605-17)中描述。
[0090]所述方法还可利用地塞米松(Dexamethasone)和维生素D3,或致敏耐受(tolerogenised)或未成熟DC代替步骤b)的DC来进行。
[0091]另一种用于获得人Trl细胞的方法，其包括:
[0092]a)在具有适量IFN- a的培养基中，培养从受试对象中分离的针对抗原的CD4+T细胞群，和
[0093]b)回收所述Trl细胞群。
[0094]IFN-a优选地在培养基中以5ng/ml存在。在步骤a)中，所述培养基可进一步包含适量的IL-10，优选地为100U/ml。
[0095]在步骤b)中，所述Trl细胞群在包含IL-15的培养基中培养以进行增殖，IL15在培养基中优选地为5ng/ml。所述用于获得Trl细胞的方法在专利US6，746，670中描述。
[0096]另一种用于获得人Trl细胞的方法，其包括:
[0097]a)在由人工抗原呈递细胞呈递的抗原存在的情况下，体外活化CD4+T细胞群，和
[0098]b)回收包含至少10%Trl细胞的活化⑶4+T细胞。
[0099]优选地，所述人工抗原呈递细胞表达HLA II系统分子和人LFA-3分子，不表达共刺激分子 B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23 和 ICAM-10
[0100]用于获得Trl细胞的所述方法在专利申请W002/092793中描述。
[0101]另一种用于获得人Trl细胞的方法,其包括:
[0102]a)在抗原和适量IL-10存在的情况下，体外活化⑶4+T细胞群；和
[0103]b)回收所述Tr I细胞群。
[0104]优选地，IL-10在培养基中以100U/ml存在。所述获得Trl细胞的方法在Groux等(Nature 1997, 389(6652):737-42)中描述。
[0105]另一种用于获得人Trl细胞的方法，其包括:
[0106]a)用抗原刺激白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群，
[0107]b)从所述经刺激的群中回收抗原特异性Trl细胞群，
[0108]c)任选扩增所述抗原特异性Trl细胞群。用于获得Trl细胞的所述方法在W02007010406 中描述。
[0109]另一种用于获得人Trl细胞的方法包括在IL-27和TGF-P存在的情况下培养 CD4+T 细胞，例如在 Awasthi 等.Nat.Tmmuno1.20078 (12): 1380 或 Apetoh 等.Nat.1mmuno 1201011 (9):854 中描述的。
[0110]白细胞包括数种类型的细胞，其通过它们的重要性、它们的分布、它们的数量、它们的寿命和它们的潜能来表征。这些类型如下:多核或粒细胞，其中有嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞；以及单核细胞或外周血单核细胞(PBMC)，其为大的白细胞并且组成免疫系统的主要细胞类型(淋巴细胞和单核细胞)。白细胞或PBMC可通过本领域的技术人员已知的任何方法从外周血中分离。有利地，对于PBMC的分离，可使用离心，优选地使用密度梯度离心，优选地使用不连续密度梯度离心。备选方法是使用特异性单克隆抗体。在某些实施方案中，PBMC典型地通过聚鹿糖-泛影钠(Ficoll-Hypaque)使用标准过程从全血产品中分离。在其它的实施方案中，PBMC通过白细胞分离术进行回收。
[0111]所述方法在专利申请W02007/010406中描述。
[0112]另一种获得人Trl细胞的方法，其包括:
[0113]a)在抗原存在的情况下培养白细胞群或外周血单核细胞(PBMC)群与间充质干细胞，
[0114]b)回收Tr I细胞群。
[0115]所述方法还可使用初始T细胞或记忆性T细胞代替PBMC或白细胞来进行。
[0116]由此获得的Trl细胞群可通过在细胞因子例如白细胞介素-2和白细胞介素-4存在的情况下培养来进一步扩增。或者，白细胞介素-15和白细胞介素-1也可用于Trl细胞的扩增培养。
[0117]Trl细胞可通过Elisa、流式细胞术或免疫亲和法，使用针对包括⑶4+、⑶11a+、CD18+、PSGL-l+/_、IL-10在内的标记的抗体来鉴定和/或纯化。
[0118]Trl细胞还可使用流式细胞术或磁珠，通过阳性选择或阴性选择来富集。此类方法也在W02005/000344中描述。
[0119]一种用于体外扩增T`rl细胞的方法在W02006/108882中描述。所述方法包括:
[0120]a)在低于35°C的温度Tl下，在培养基Mf中培养饲养细胞，例如昆虫饲养细胞，所述温度Tl允许饲养细胞增殖并且所述饲养细胞表达与以下细胞表面蛋白相互作用的因子:
[0121]-CD3/TCR 复合体，
[0122]-CD28 蛋白，
[0123]-1L-2 受体，
[0124]-CD2 蛋白，
[0125]-1L-4 受体，
[0126]b)使步骤a)中获得的已清除或未清除培养基Mf的饲养细胞与在培养基Mp中含有的Trl细胞群接触，其中所述培养基Mp最初不含步骤a)中列出的因子，以获得Trl细胞群、饲养细胞和培养基Mp的混合物，
[0127]c)在至少35°C的温度T2下培养步骤b)中获得的混合物，选择所述温度使得所述Trl细胞群增殖且所述饲养细胞不增殖，
[0128]d)回收如此扩增的Trl细胞群。
[0129]与上述细胞表面蛋白相互作用的因子的实例包括:
[0130]-抗-⑶3单克隆抗体或修饰的抗-⑶3抗体，其中⑶3重链的抗-⑶3胞浆内结构域被跨膜结构域替代，
[0131]-CD80 蛋白或 CD86 蛋白，
[0132]-由所述饲养细胞分泌的IL-2，
[0133]-CD58 蛋白，[0134]-选自IL-4和IL-13的白细胞介素。
[0135]抗-⑶3单克隆抗体可用于经TCR/⑶3复合体来活化T细胞群，所述抗-⑶3单克隆抗体有利地是经过修饰的抗-CD3抗体，其中抗-CD3抗体的修饰是用跨膜结构域替换胞浆内结构域来组成，使得所述经过修饰的抗-CD3抗体锚定到饲养细胞的细胞膜上并与T细胞的CD3/TCR蛋白复合体相互作用。与抗原特异性Trl细胞表面上存在的CD28蛋白相互作用且由所述饲养细胞表达的因子可为能够交联CD28分子的抗-CD28单克隆抗体或其片段；在这样的情况下，可构想通过添加跨膜结构域以使其锚定到饲养细胞的细胞表面上来对抗-CD28单克隆抗体进行修饰。优选地，应用CD28分子的天然配体而非抗-CD28单克隆抗体，也就是说，例如B7蛋白家族的成员，例如B7-l(⑶80)蛋白和B7-2(⑶86)蛋白。
[0136]由饲养细胞表达且与⑶2相互作用表达的因子可为能够交联⑶2分子的抗-⑶2单克隆抗体或其片段；可构想通过添加用于锚定到饲养细胞的细胞表面上的跨膜结构域来对抗-CD2单克隆抗体进行修饰。优选地，采用CD2的天然配体代替抗-CD2单克隆抗体，也就是说⑶58蛋白。
[0137]除了锚定至饲养细胞的细胞膜上的因子之外，被分泌的因子，例如白细胞介素，对于抗原特异性Trl细胞群的扩增也是必需的。在这些白细胞介素中，有IL-2，其与抗原特异性Trl细胞的表面上存在的IL-2受体相互作用；并且还有IL-4或IL-13，其与抗原特异性Trl细胞的IL-4受体相互作用。
[0138]另一种用于扩增Trl细胞的方法包括在细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL_13和/或IL-15)存在的情况下用抗-⑶3/28珠培养Trl细胞。
[0139]一种用于分离天然的调节性T细胞的方法包括:基于包括⑶4+、⑶25+和⑶127?A在内的标记组合，利用流 式细胞术来分选天然的调节性T细胞。该方法导致>95%FoxP3+的高度富集的细胞群。
[0140]另一种用于分离天然的调节性T细胞的方法包括:基于包括⑶45RA+、⑶4+和⑶25+在内的标记组合，利用流式细胞术来分选天然的调节性T细胞。所述方法在US2010/291678中描述。
[0141]一种用于扩增天然的调节性T细胞的方法也在US2010/291678中描述，并使用抗-⑶3/28单克隆抗体(mAb)包被的珠并联合IL-2和辐照过的饲养细胞。
[0142]另一种用于获得天然的调节性T细胞的方法包括:基于CD25的表达利用流式细胞术来分选天然的调节性T细胞，并通过以下来扩增它们:
[0143]-在IL_2(10U/1)存在的情况下以T细胞:DC为10:1的比例将其与自体单核细胞来源的树突状细胞培养，或
[0144]-将其用雷帕霉素培养。
[0145]另一种用于获得天然的调节性T细胞的方法包括:在TGF-P存在的情况下同时进行抗-⑶3/⑶28刺激，将⑶4+⑶25-T细胞培养5天。
[0146]一种用于分离调节性NK T细胞的方法包括利用负载有a GalCer的⑶Id多聚体。
[0147]另一种用于分离调节性NK T细胞的方法包括利用6B11单克隆抗体。
[0148]另一种用于分离调节性NK T细胞的方法包括利用对Va 24和VP 11染色的抗体或对V a 24染色的抗体。
[0149]一种用于获得调节性Th3细胞的方法包括在TGF-P存在的情况下同时进行抗-⑶3/28刺激，培养⑶4+T细胞。
[0150]一种用于体外扩增Y 8 T细胞的方法包括:通过在细胞因子例如IL-2、IL-15和TGF-^存在的情况下，用含有核苷酸的细菌来源的磷酸化化合物或通过类异戊二烯焦磷酸例如异戊烯焦磷酸(IPP)刺激外周血单核细胞(PBMC)开始(参见例如W003/070921、W02009037723)o
[0151 ] 依据本发明，上述的调节性T细胞用于治疗患有自身免疫性疾病、炎性病症、变态性或哮喘性病况、移植物抗宿主疾病或正经历移植的患者。
[0152]依据本发明，上述方法用于治疗患有自身免疫性疾病、炎性病症、变态性或哮喘性病况、移植物抗宿主疾病或正经历移植的患者。[0153]在本发明的一个实施方案中，所述移植可为造血干细胞移植或实质器官(肝、肾、肺、心脏等)移植。
[0154]在本发明的另一个实施方案中，自身免疫性疾病的实例包括但不限于糖尿病、多发性硬化症和关节炎病况。
[0155]“关节炎病况”是指类风湿关节炎、多软骨炎、脓毒性关节炎、脊柱关节病或强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎和关节炎相关疾病例如系统性狼疮红斑、干燥综合征、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛症、结节病、血管炎。
[0156]在本发明的另一个实施方案中，炎性病症的实例包括但不限于炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与食物变态反应或食物不耐受相关的肠道炎症，牛奶蛋白变态反应相关的肠道炎症、腹腔疾病相关的肠道炎症、鸡蛋变态反应相关的肠道炎症或花生变态反应相关的肠道炎症。
[0157]在本发明的另一个实施方案中，变态性或哮喘性病况的实例包括但不限于哮喘、特应性皮炎、变态性鼻炎、结膜炎、湿疹、接触性变态反应、吸入性变态反应、食入性变态反应和过敏反应。
[0158]在本发明的一个实施方案中，收集待治疗受试对象的血液样品。
[0159]特异性针对所选择抗原的Trl细胞通过将PBMC与所选择抗原培养7天来获得。任选可在第3天将细胞因子例如IL-2和IL-4加入所述培养物中。
[0160]接着将获得的Trl细胞通过常规方法克隆并进一步扩增。
[0161]优选地，针对所选择抗原的Trl克隆的扩增用本文上述的以下方法来进行:
[0162]a)在低于35°C的温度Tl下，在培养基Mf中培养饲养细胞，例如昆虫饲养细胞，所述温度Tl允许饲养细胞增殖且所述饲养细胞表达与以下细胞表面蛋白相互作用的因子:
[0163]-CD3/TCR 复合体，
[0164]-CD28 蛋白，
[0165]-1L-2 受体，
[0166]-CD2 蛋白，
[0167]-1L-4 受体，
[0168]b)使步骤a)中获得的已清除或未清除培养基Mf的饲养细胞与在培养基Mp中含有的Trl细胞群接触，其中所述培养基Mp最初不含步骤a)中列出的因子，以获得Trl细胞群、饲养细胞和培养基Mp的混合物，
[0169]c)在至少35°C的温度T2下培养步骤b)中获得的混合物，选择所述温度使得所述Trl细胞群增殖且所述饲养细胞不增殖。
[0170]d)回收如此扩增的Trl细胞群。
[0171]最终制备了包含IO4-1O6个对所选择抗原具有特异性的的Trl细胞的有效剂量，并回输至患者中。
[0172]在本发明的一个实施方案中，待施予患者用于治疗肠道炎症病况的调节性T细胞为特异性针对来自普通人类饮食的食物抗原的Trl细胞。
[0173]在本发明的另一个实施方案中，所述Trl细胞是特异性针对卵清蛋白的，并旨在用于治疗炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、与食物变态反应或食物不耐受相关的肠道炎症，牛奶蛋白变态反应相关的肠道炎症、腹腔疾病相关的肠道炎症、鸡蛋变态反应相关的肠道炎症 或花生变态反应相关的肠道炎症。
[0174]在本发明的一个实施方案中，待施予患者用于治疗多发性硬化症病况的调节性T细胞为特异性针对多发性硬化症相关抗原的Trl细胞。
[0175]在本发明的另一个实施方案中，所述Trl细胞是特异性针对MBP或MOG的，并旨在治疗多发性硬化症。
[0176]在本发明的一个实施方案中，待施予患者用于治疗关节炎病况的调节性T细胞为特异性针对关节相关抗原的Trl细胞。
[0177]在本发明的另一个实施方案中，所述Trl细胞是特异性针对II型胶原蛋白或HSP抗原的，并旨在用于治疗类风湿关节炎、多软骨炎、脓毒性关节炎、脊柱关节病或强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎和关节炎相关疾病例如系统性狼疮红斑、干燥综合征、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛症、结节病、血管炎。
[0178]在本发明的一个实施方案中，待施予患者用于治疗变态性或哮喘性病况的调节性T细胞为特异性针对与所述变态性或哮喘性病况相关变应原的Trl细胞。
[0179]在本发明的另一个实施方案中，所述Trl细胞特异性针对源自花粉(Cup，Jun)、屋尘螨(0#，617，171~，1印)、狗、猫和啮齿动物(Can, Fel, Mus, Rat)的变态原，并旨在用于治疗哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、结膜炎、湿疹和过敏反应。



[0180]图1:5周(A)和8周⑶后CDAI个体对治疗的响应。
[0181]图2:5周和8周后CDAI群组对治疗的响应(A)以及8周后IBDQ群组对治疗的响应(B)。
[0182]图3:响应百分比(A)和缓解百分比(B)。
[0183]图4: (A)响应者的PBMC对卵清蛋白的体外增殖响应。(B)群组对卵清蛋白的增殖减少的百分比。
[0184]图5:以不同剂量输注两次卵清蛋白特异性Trl细胞的克罗恩病患者中的CDAI个体响应。R=有响应；NR=无响应。
[0185]图6:细胞输注后8周期间克罗恩病患者的CDAI个体响应。黑色圆圈:106剂量；白色方框:IO9剂量。
[0186]实施例
[0187]实验方案[0188]卵清蛋白特异性Trl克隆的产生
[0189]卵清蛋白特异性Trl克隆产生自克罗恩病患者的外周血单核细胞(PBMC)。在通过聚鹿糖密度梯度离心(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)将PBMC分离后,在37°C，5%C02下将细胞培养于含福照过的天然卵清蛋白(Sigma Aldrich, St-Louis, MO, USA)的X-Vivol5 (Cambrex, East Rutherford, NJ)和细胞因子富集的果蚬饲养细胞上清液中。培养数天后，通过有限稀释法于37°C，5%C02下在X-Vivol5中在果蝇饲养细胞层上克隆细胞。接着收集生长中的克隆并测试抗原特异性和Trl细胞身份，然后在果蝇饲养细胞上扩增到最多达50亿个。
[0190]果蝇饲养细胞
[0191]果蝇饲养细胞由TxCell改造以改善Trl细胞克隆的刺激和生长。将Schneider2果蝇细胞用跨膜形式的小鼠抗-人⑶3抗体、用人⑶380、人⑶58、人IL-2和人IL-4转染。将细胞常规生长于PAA实验室的Express five培养基(Pashing, Austria)中。
[0192]克罗恩病患者的Trl细胞治疗
[0193]进行I/IIa期临床试验以评估在重度难治的克罗恩病患者中启动的对Trl治疗的耐受性。当CDAI (克罗恩病活动指数，参见以下用于描述)高于220时(此时确认为疾病活动期)，将4个剂量(106、IO7UO8和IO9)自体卵清蛋白特异性Trl细胞静脉输注到患者中。接着在12周期间监控患者的疾病活动性。
[0194]临床响应评估
[0195]克罗恩病活动指数或CDAI是用于量化克罗恩病患者的疾病活动性的研究工具。这在针对用于治疗克罗恩病的药物的研究中是非常重要的；对新药物进行的大多数主要研究使用CDAI以限定疾病的响应 或缓解情况。高于220的分数确定患者具有活跃的病变；低于或等于150的CDAI确定患者处于疾病的缓解期。在患者治疗后与基线(治疗前获得的CDAI)相比的CDAI的100分的减小被视为对治疗有响应。
[0196]在第0周(输注前的那周)和Trl细胞输注后1、2、3、5、和8周计算CDAI。
[0197]CDAI 计算
[0198]