专利名称：尺寸均一、储存稳定的亲水性药物的复乳载体及其制备方法 许多抗癌药物、蛋白质等生物活性药物均属于亲水性药物，例如，丝裂霉素C、阿霉素、顺铂、肿瘤坏死因子等均为是常用的亲水性抗癌药物，这些药物如果直接投入人体，会随机地分布在人体的各个部分，对正常细胞产生严重的杀伤作用，造成人体的免疫力降低。同时这些低分子药物会迅速被肾小球过滤，排除体外。要使血液内的药物浓度保持有效治疗浓度以上，必须频繁用药，对人体造成很大的副作用。因此，对副作用大、半衰期短的剧毒药物的包埋，提高其在体内半衰期，减少其副作用一直是受到极大关注的问题。用W/O/W型复乳包埋亲水性药物是常用的一种制备控释制剂的方法，被应用于各种治疗。其原理是将包埋了抗癌剂的乳液或微球药物载体，导入肝癌细胞的营养动脉，使其停留在该营养动脉内，一方面隔断向癌细胞供应营养，降低癌细胞的生长速度，另一方面使药物载体向癌细胞以一定的速度释放药物，杀死癌细胞。用超液化碘油作为油相，以丝裂霉素C或阿霉素的水溶液为内水相，制备出的复乳载体是常用的动脉栓塞用药物载体。这是因为碘油与癌细胞有特殊的亲和作用，代谢慢，可以长时间地滞留在患部，起到靶向和控释作用[2]。但是，现有的制备法(机械搅拌法)制备出来的复乳药物载体，粒径不均一、包埋率低、储存性能不稳定。例如，将抗癌药的复乳载体用于肝癌的动脉栓塞治疗时，由于粒径不均一，将复乳药物载体注入肝动脉后，小的液滴会随着血流进入静脉，从而分布于其它健康组织，造成严重的副作用。另外，由于复乳不稳定，水相和油相会快速分离，不能长时间储存，必须由医生在治疗前自己制备，从而造成治疗重复性差；即使制备后立即使用，油相和水相也会在肝动脉内产生分离，碘油虽然继续停留在癌组织内，药物却随着血流迅速流往其它健康组织，而造成严重的副作用[3]。所以，现在还没有一种抗癌剂的碘油复乳制剂上市。因此，提高复乳药物载体的稳定性不仅可以减少剧毒药物的副作用，还可以实现由生产商事先制造，运往各医院使用的流程，以达到治疗重复性好。并可望能减小剧毒药物的副作用，提高治疗效果。有学者通过在内水相中添加葡萄糖的方法，延缓了药物向外泄漏的时间，但药物仍会逐渐向外泄漏，无法长时间保存。Nakano等[4]通过在油相添加比重轻的物质，以使碘油比重和水相比重相近，降低分层速度，但是效果仍然不理想。因此，制备尺寸均一、稳定的亲水性药物的复乳载体是极其重要的。分析乳液不稳定的原因，是因为粒径不均一。粒径不均一时，小液滴的表面张力大，容易被大液滴吞并，最终造成油水分层。因此，制备尺寸均一的复乳药物载体是制备稳定的乳液药物载体的关键。针对现有复乳载体制备方法存在的粒径分布宽、稳定性差的问题，在申请号为03130833.3的发明专利中，我们用微孔膜乳化法，分别对常用的抗癌剂(丝裂霉素C、盐酸阿霉素)进行了包埋，粒径分别控制在14％以内，包埋率达92％以上。粒径尺寸、包埋率以及储存稳定性远远超出用以往配方和制备法无法达到的水平。但是，在储存30天后仍有15％左右的药物释放。如能进一步提高稳定性，并调控释放速度，将更能减少副作用，适合产业化，实现由生产商实现制造，再运往各医院使用的流程。本发明分别在油相和内水相中添加生物大分子胆固醇、卵磷脂及血清白蛋白，达到了提高稳定性和控制释放的目的。本发明主要是基于以下设想1)在油相中添加脂质体的组成成分卵磷脂和胆固醇脂质体已被广泛用于注射用抗癌剂的包埋研究，这是因为脂质体载体可以在某种程度上提高化疗效果的靶向性，并大幅度地降低化疗药物的毒副作用，提高化疗药物的治疗指数。与目前其它的抗癌药物剂型相比较，脂质体具有独特的优点脂质体作为抗肿瘤药物载体具有能增加与肿瘤细胞的亲和力，克服耐药性，增加药物对肿瘤细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效，降低毒副作用的特点。由于肿瘤细胞中含有比正常细胞较高浓度的磷脂酶及酰胺酶，因此如将抗癌剂包埋在脂质体内，不仅由于酶解使药物容易释出，而且亦可促使药物在肿瘤细胞部位特异地蓄积。另外卵磷脂与胆固醇能在油/水相界面形成稳定的膜，因此，本研究设想在碘油油相内添加磷脂和胆固醇，使之在油相内形成的脂质体，或在内水相和油相之间形成稳定的膜，防止内水相中的药物向外扩散，提高载体的稳定性。另一方面，实际应用时，期望药物能以脂质体的形式释放出来，进一步提高载体的靶向性并减少副作用。2)在内水相中添加牛血清白蛋白白蛋白的化学性能稳定、无毒，自1974年首次作为抗癌药物载体以来，相继用作诊断试剂及靶向给药、化学栓塞治疗的载体。本发明设想在内水相中添加白蛋白，通过白蛋白与阿霉素之间的静电引力，延缓阿霉素向外释放。另外，白蛋白本身具有表面活性，能在油/水相界面上形成具有粘弹性的高分子膜，提高界面膜的机械强度。与先制备成白蛋白微球后，再分散在碘油内的方法相比，工艺简单，包埋率高。

本研究针对亲水性药物，提供尺寸均一、储存稳定的复乳药物载体，以用于癌症的动脉栓塞化疗等。其特征是含有亲水性药物的水溶液与含乳化剂的油性物质混合，同时在混合前在内水相添加白蛋白或在油相内添加卵磷脂与胆固醇；用超声乳化器或均相乳化器制备成水包油型乳液后，将该乳液用压力通过微孔膜压入外水相，得到尺寸均一的复乳药物载体。在优化条件下，载体的直径分布系数控制在10％以内，直径可在1-100微米内自由控制；包埋率高、储存稳定，在优化条件下包埋率达99.2％，在4℃储存30天以上药物释放率可控制在4.43％以内，而在37℃条件下，能够以一定速度释放出来。与不加添加剂相比，进一步提高了储存稳定性，可以解决储存和运输时稳定，治疗时达到药物缓慢释放的双重目的。
该技术解决了搅拌乳化法制备的亲水性药物的复乳载体的粒径不均一、包埋率低、储存稳定性差的问题。可望实现由生产商事先制备后，运往各医院的流程，克服必须由医生手术前现场制备的问题。同时，可望减小抗癌药等亲水性药物的毒副作用，提高治疗效果。
本复乳药物载体、制备方法及其最优配方还能够带来下列效应(1)本专利提供的复乳药物载体除肝癌的动脉栓塞治疗以外，还可用于肺癌[5]、胃癌[6]的动脉的栓塞治疗。调控复乳药物载体的粒径，还可将其用于静脉注射、皮下注射、腹腔注射等。
(2)本专利提供的复乳药物载体，由于粒径均一并且可控，使用本复乳药物载体可以开展粒径和治疗效果关系的研究。这是因为复乳的粒径与其在癌组织内的分布位置和时间可能有较大关系。如果药物载体的尺寸不均一，则无法开展这方面的研究。
(3)本专利所使用的制备方法可用于所有的亲水性药物的包埋，如蛋白质、核酸、激素等生物活性药物等。尤其是温和的乳化条件可望能够保持生物活性药物的活性。


图1丝裂霉素C和阿霉素复乳药物载体的制备流程。
图2实施例1制备的丝裂霉素C复乳药物载体(油相中含卵磷脂与胆固醇)的光学显微镜照片。
图3实施例1制备的丝裂霉素C复乳药物载体(油相中含卵磷脂与胆固醇)的粒径分布图(测定仪器激光粒度仪COULTER LS230)。
图4实施例1和比较例1制备的丝裂霉素C复乳药物载体的储存稳定性和释药曲线。
图5实施例4和比较例2制备的阿霉素复乳药物载体的储存稳定性和释药曲线。
具体实施方案本发明包括尺寸均一、储存稳定的亲水性药物的复乳载体及其制备方法。亲水性药物的复乳载体的制备按图1所示步骤制备，具体方法和步骤说明如下1)W/O型初乳的制备将亲水性药物、白蛋白以及其它添加剂溶解于水，作为内水相；将油溶性乳化剂、卵磷脂与胆固醇的混合物及其它添加剂溶于油性液体；作为油相。将内水相与油相混合，用均相乳化器制备成W/O型初乳。
内水相添加剂可包括其它蛋白质、氯化钠、多醇等对人体无害的水溶性物质；亲水性药物包括抗癌药物、多肽、蛋白质药物、核酸、疫苗、激素、抗菌素等，可根据治疗需要一起或单独溶解于内水相。油相为常温下呈液体状，与水互不相溶的油性物质。亲油性物质在水中的溶解度，在25℃条件下最好小于0.2wt％，可使用碘油、橄榄油、棉花籽油、豆油、烷类炭氢化合物等。油性乳化剂必须溶解于所使用的油性物质，可使用聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨糖醇三油酸酯(司班85)、失水山梨糖醇油酸酯(司班80)、失水山梨糖醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物。油相中的油相乳化剂浓度为1-10wt％。如需要一起使用亲油性药物，可将该亲油性药物溶于该油性物质中。白蛋白在水相中的浓度为0.1-30.0wt％，卵磷脂、胆固醇在油相中的摩尔比为1∶1-1∶3，胆固醇的浓度为0.1-2.0wt％。
内水相与油相的体积比为1∶1-1∶10。油相与外水相的体积比为1∶1-1∶100。
2)W/O/W复乳的制备将一种以上的水溶性悬浮稳定剂和/或乳化剂溶解于水中，作为外水相。将上述步骤1)所得到的初乳通过多孔膜压入外水相。
上述外水相中的水溶性悬浮稳定剂可使用聚乙烯醇、聚吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧乙烯加氢蓖麻油、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯(吐温20)、亲油性-亲水性嵌断共聚物等。水溶性乳化剂的使用范围为0.1-20wt％。
上述外水相中的水溶性乳化剂可使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等阴离子型表面活性剂、烷基铵盐、烷基苄基铵盐等阳离子型表面活性剂、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚乙二醇硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇硬脂酸酯等非离子型表面活性剂。表面活性剂的使用范围为外水相的0.01-10wt％。
实施例1(油相中添加卵磷脂与胆固醇的混合物)将孔径为7μm的微孔膜置于亲水性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。配制丝裂霉素C的葡萄糖水溶液2.5ml，葡萄糖浓度为5.8wt％，丝裂霉素C的添加量为2.67mg/ml水。将该水溶液与5.0ml溶有摩尔比为1∶1的卵磷脂和胆固醇的超液化碘油(胆固醇含量0.1-2.0wt％)相混合，油水相体积比为2∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的丝裂霉素C碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为38.56μm，CV值为15.5％。光学显微镜照片如图2所示，粒径分布如图3所示，粒径分布非常均一。
取20g的丝裂霉素C碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃和37℃的水中做透析试验，并以100rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在365nm处测定丝裂霉素C的浓度后，计算外水相中的丝裂霉素C的浓度。将3小时后(4℃)的外水相中的丝裂霉素C的浓度换算为包埋浓度。结果如图4所示，包埋率达93.61％，4℃条件下储存稳定性好，经过储存30天以上，丝裂霉素C的释放率为9.82％。而在37℃条件下，丝裂霉素C能以一定速度向外释放。
比较例1(油相中未添加卵磷脂与胆固醇的混合物)采用与实例1相同的配方，配制丝裂霉素C的葡萄糖水溶液2.5ml，葡萄糖浓度为5.8wt％，丝裂霉素C的添加量为2.4mg/ml水。将该水溶液与5.0ml的超液化碘油(溶有油溶性乳化剂)混合，油水相体积比为2∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮剂的乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的丝裂霉素C碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为45.12μm，CV值为13.2％。
取20g的丝裂霉素C碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃的水中做透析试验，并以100rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在365nm处测定丝裂霉素C的浓度，计算外水相中的丝裂霉素C的浓度。结果如图4所示，包埋率为93.69％，4℃条件下稳定储存30天后，丝裂霉素C的释药量为12.62％。
实施例2(油相中添加卵磷脂与胆固醇的混合物)将孔径为7μm的微孔膜置于亲水性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。配制丝裂霉素C的葡萄糖水溶液，葡萄糖浓度为5.8wt％，丝裂霉素C的添加量为2.4mg/ml水。将该水溶液与5ml溶有摩尔比为2∶1的卵磷脂和胆固醇(胆固醇含量0.4％)的超液化碘油(溶有油溶性乳化剂)混合，油水相体积比为3∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的丝裂霉素C碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为44.15μm，CV值为12.4％。
取20g的丝裂霉素C碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃的水中做透析试验，并以100rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在365nm处测定丝裂霉素C的浓度，计算外水相中的丝裂霉素C的浓度。将3小时后(4℃)的外水相中的丝裂霉素C的浓度换算为包埋浓度。结果包埋率达96.75％，4℃条件下稳定储存30天后，丝裂霉素C的释药量为4.43％。
实施例3(内水相中添加内白蛋白)将孔径为7μm的微孔膜置于亲水性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。配制阿霉素的葡萄糖水溶液，葡萄糖浓度为5.8wt％，牛血清白蛋白的添加浓度为0.5wt％，阿霉素的添加量为12.0mg/ml水。将该水溶液与5ml的超液化碘油(溶有油溶性乳化剂)混合，油水相体积比为3∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将1.0g的水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的阿霉素碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTERLS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为41.27μm，CV值为13.4％。
取20g的阿霉素碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃的水中做透析试验，并以100rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在254nm处测定阿霉素的浓度，计算外水相中的阿霉素的浓度。将3小时后(4℃)的外水相中的阿霉素的浓度换算为包埋浓度。结果包埋率达99.19％，4℃条件下稳定储存30天后，阿霉素的释药量为5.93％。
比较例2(内水相中未添加白蛋白)将孔径为7μm的微孔膜置于亲水性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。配制阿霉素的葡萄糖水溶液，葡萄糖浓度为5.8wt％，阿霉素的添加量为12.0mg/ml水。将该水溶液与5ml的超液化碘油(溶有油溶性乳化剂)混合，油水相体积比为3∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的阿霉素碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为43.40μm，CV值为10.8％。
取10g的阿霉素碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃的水中做透析试验，并以120rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在486nm处测定阿霉素的浓度，计算外水相中的阿霉素的浓度。将3小时后(4℃)的外水相中的阿霉素的浓度换算为包埋浓度。结果包埋率达98.6％，4℃条件下稳定储存30天后，阿霉素的释药量为9.36％。
实施例4(内水相中添加内白蛋白)将孔径为7μm的微孔膜置于亲水性的物质中浸润，使孔膜充分湿润。配制阿霉素的葡萄糖水溶液，葡萄糖浓度为5.8wt％，牛血清白蛋白的添加浓度为0.1wt％，阿霉素的添加量为12.0mg/ml水。将该水溶液与5ml的超液化碘油(溶有油溶性乳化剂)混合，油水相体积比为3∶1。用均相乳化器乳化3min，得到W/O型初乳。将1.0g的水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入100ml水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将8.0g的W/O型初乳用0.085Kgf/cm2的恒定压力，通过孔径均一的亲水性微孔膜压入外水相，得到W/O/W型的阿霉素碘油复乳载体。用激光粒度仪(COULTERLS230)测试复乳药物载体的直径，平均直径为36.41μm，CV值为15.6％。
取20g的阿霉素碘油复乳药物载体装入透析袋，置于4℃的水中做透析试验，并以100rpm/min的速度振荡。每隔一定的时间，从透析袋外的水中取样，用紫外分光法在254nm处测定阿霉素的浓度，计算外水相中的阿霉素的浓度。将3小时后(4℃)的外水相中的阿霉素的浓度换算为包埋浓度。结果包埋率达97.41％，4℃条件下稳定储存30天后，阿霉素的释药量为8.24％。
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本研究针对亲水性药物，提供尺寸均一、储存稳定的复乳药物载体，以用于癌症的动脉栓塞化疗等。其特征是含有亲水性药物的水溶液与含乳化剂的油性物质混合，同时在混合前在内水相添加白蛋白或在油相内添加卵磷脂与胆固醇；用超声乳化器或均相乳化器制备成水包油型乳液后，将该乳液用压力通过微孔膜压入外水相，得到尺寸均一的复乳药物载体。在优化条件下，载体的直径分布系数控制在10％以内，直径可在1－100微米内自由控制；包埋率高、储存稳定，在优化条件下包埋率达99.2％，在4℃储存30天以上药物释放率可控制在4.43％以内，而在37℃条件下，能够以一定速度释放出来。与不加添加剂相比，进一步提高了储存稳定性，可以解决储存和运输时稳定，治疗时达到药物缓慢释放的双重目的。该技术解决了搅拌乳化法制备的亲水性药物的复乳载体的粒径不均一、包埋率低、储存稳定性差的问题。可望实现由生产商事先制备后，运往各医院的流程，克服必须由医生手术前现场制备的问题。同时，可望减小抗癌药等亲水性药物的毒副作用，提高治疗效果。