一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法

姜小凤, 童再康, 时剑, 高燕会

2013年3月20日

2012年6月28日

2012年6月28日

浙江农林大学

A01H4/00GK102972289SQ20121023048

石蒜 组培快 叶片 利用 中国

1.一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法，其技术方案按如下步骤进行 (1)培养基配方和配制 适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方MS+6-BA 20mg/L+NAA I. Omg/L+蔗糖30g/L 适宜无菌小叶诱导的培养基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L 继代培养培养基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+ 蔗糖 30g/L 生根培养培养基配方1/2MS+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L 具体的配制方法 A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸懼水，定容至I升； B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止； C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，IL一般可分装成20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121 °C，维持时间18-25min ； D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭囷后的两周内用完(2)叶片采集和处理 A 采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室； B 选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成Icm左右的片断，直接接种； (3)灭菌和接种 将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌75%乙醇中消毒30-60S —无菌水清洗2次一O. I % HgCl2溶液中灭菌8-10min —无菌水清洗4次一无菌滤纸吸干表面水分； 然后用解剖刀将叶段切成O. 8-1. Ocm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行； (4)培养条件 将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度25±2°C ； 继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000-12001X，光照时间16小时，温度25±2°C ； (5)继代培养 待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到O. 5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上，继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖； (6)生根培养 继代培养得到的小鳞茎达到O. 5cm以上时，即可进行生根培养，将生长势健壮的中国石蒜小苗转接于生根培养基上，待长出3条以上的白色根须后，进行驯化；(7)驯化移栽 A、驯化炼苗分两步进行，第一步，每天将培养瓶的盖子揭开一段时间，使幼苗接触外界空气，并逐渐延长时间，大约一周后完全揭开瓶盖； B、第二步，将幼苗取出，用清水清洗，除去附着的培养基，然后修剪较长的根须，移栽于基质中，基质由泥炭珍珠岩蛭石按111配制，保持基质湿润，空气湿度在90%以上，并加盖遮阳网； C、两周后，待幼苗叶片伸展，即可除去遮阳网，进行正常栽培管理

本发明涉及一种利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系快速培养再生植株的方法2.背景技术中国石蒜Lycoris chinensis 属石蒜科 Amaryllidaceae 石蒜属 Lycoris 植物,广泛分布于东亚地区，在国内主要分布于长江流域以及西南诸省，以其独特的龙爪形花瓣而著称，花朵色彩艳丽，花形优美，是一类优良的球根花卉植物和药用植物目前，已在华东地区的城市绿化中得到应用，但是，自然条件下，中国石蒜主要依靠鳞茎分球进行繁殖，繁殖系数较低，难以满足大规模的生产需要由于快繁技术措施的滞后，园林应用与药用的采挖已严重影响其野生资源的数量，部分地区的野生种群已遭到毁灭性破坏，因此，解决其快繁技术问题已成为中国石蒜野生种群保护与园林生产应用的关键组织培养技术作为植物品种快繁的主要手段已在鳞茎类植物中得到较为广泛的应用，它可以大幅度提高鳞茎的繁殖系数，满足中国石蒜快速大规模繁育生产的需要尤其是利用中国石蒜的叶片作为外植体材料，进行诱导培养，并再生植株的新技术，不但能够实现中国石蒜的快速商业化生产，还具有不破坏母鳞茎、保护珍稀种质的优点，对于中国石蒜野生种群的保护具有特殊意义CN102217540A公开了周坚的“一种中国石蒜的快速繁殖方法”发明专利技术，以中国石蒜的种胚为外植体，诱导再生植株，这种方法虽然繁殖系数较高，但种子的遗传背景较复杂，繁育出的后代性状有分离现象，限制了中国石蒜纯系品种的推广应用而且以种胚作外植体只能一次性使用，采用叶片作外植体则可以多次采集并保存原鳞茎3.发明内容针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系培养再生植株解决上述技术问题的技术方案是按如下步骤进行(I)培养基配方和配制适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方MS+6-BA 20mg/L+NAA I. Omg/L+蔗糖 30g/L适宜无菌小叶诱导的培养基配方MS+6-BA O. 5mg/L+2,4-D I. Omg/L+鹿糖30g/L继代培养培养基配方MS+6-BAO. 5mg/L+2，4-D I. Omg/L+ 蔗糖 30g/L 生根培养培养基配方1/2MS+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L具体的配制方法A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸懼水，定容至I升；B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5. 9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止；C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，IL 一般可分装成20-22瓶， 然后盖上盖子并注明标签最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121 °C，维持时间18-25min ；D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭囷后的两周内用完(2)叶片采集和处理A 采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室；B 选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成Icm左右的片断，直接接种；(3)灭菌和接种将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌75%乙醇中消毒 30-60s—无菌水清洗2次一O. 1% HgC12溶液中灭菌8-10min—无菌水清洗4次一无菌滤纸吸干表面水分；然后用解剖刀将叶段切成O. 8-1. Ocm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行；(4)培养条件将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度 25±2°C ；继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000-12001χ，光照时间16小时，温度25±2°C ；(5)继代培养待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到O. 5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上， 继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖；(6)生根培养继代培养得到的小鳞茎达到O. 5cm以上时，即可进行生根培养，将生长势健壮的中国石蒜小苗转接于生根培养基上，待长出3条以上的白色根须后，进行驯化；(7)驯化移栽A、驯化炼苗分两步进行，第一步，每天将培养瓶的盖子揭开一段时间，使幼苗接触外界空气，并逐渐延长时间，大约一周后完全揭开瓶盖；B、第二步，将幼苗取出，用清水清洗，除去附着的培养基，然后修剪较长的根须，移栽于基质中，基质由泥炭珍珠岩蛭石按I I I配制，保持基质湿润，空气湿度在 90%以上，并加盖遮阳网；C、两周后，待幼苗叶片伸展，即可除去遮阳网，进行正常栽培管理本发明的有益效果是(1)利用中国石蒜叶片作为外植体材料，建立无菌快繁体系，进行诱导培养和继代培养，并再生植株，实现中国石蒜的快速繁育(2)由无菌组织培养CN 102972289 A说明书3/3 页得到的中国石蒜幼苗，具有遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐等特点，在观赏和药用新品种栽培中具有显著的竞争优势4.