专利名称：用于从血液制备至少一种复合物的方法以及执行所述方法使用的取样设备的制作方法专利US6569204公开了一种用于从血液制备富含生长因子的组合物的方法，所述方法随着时间的经过已经表明对于各种医学应用提供了非常有意义的和有益的生物学特性。可以在临床上实施(不需要复杂的设施或手术)的这种方法主要包括以下步骤在特定的速度和温度下对包含血液和抗凝血剂的管进行离心作用一段时间，从而血液被分离成不同的级分(fraction)；提取位于红细胞(下部级分)上方的中间级分，其中所述中间级分是富含血小板的血浆；将所述血浆传送到第二管，可以对该第二管添加氯化钙，所述氯化钙作为凝血剂和血浆活化剂(一种能够启动其中生长因子被血小板释放的过程的试剂)； 等待一段时间以使血浆活化和凝结直到达到应用所要求的稠度。这种组合物在各种医学领域中的应用都已获得良好的结果，例如在骨再生(通常在移植学和创伤学中)、关节痛的治疗、皮肤治疗等领域。在US6569204本身以及在专利申请US2009035382中描述了其中一些应用。专利US6569204中公开的方法以及许多其它已知的用于制备具有希望的生物学特性的血液复合物的方法存在患者接收到受感染的最终复合物的一定的危险，这是因为在一些阶段中这些方法没有免于细菌污染。对于所述细菌污染可能有几个原因将微生物输送到血管流中的败血病，在静脉被刺入时皮肤没有充分消毒，或者由于在实施所述方法时对血液以及随后的复合物的处理。在处理过程中的导致细菌污染危险的其中一个因素是专利US6569204中公开的方法以及其它方法在开放的管内实施，S卩，所述管没有封闭或者真空密封，其结果是在该过程中获得的经过离心的血浆和复合物与周围的空气发生接触(这被称为“开放回路”)。本发明旨在提供一种用于制备从血液获得的具有有用的生物学特性的复合物的改进的方法，除了具有已知的方法的优点以外，本方法还减少了由于在方法实施期间对血液和其它随后的物质的处理而导致的对最终复合物的细菌污染的危险，并且最终产品被储存在密封的、无菌的容器中。
本发明的目的是提供一种用于从血液制备至少一种具有希望的生物学特性的复合物的方法，其中所述方法使用真空密封的管(即，内部压力低于大气压的管)。对于所述方法的大部分持续期间，优选地对于整个持续期间来说，都防止所述方法中涉及的血浆或任何其它复合物与周围的空气发生接触。根据本发明的方法在更大程度上确保了最终的一种或多种复合物不被污染以及它们的最佳的医学和生物学条件。本发明的方法包括以下步骤将一定量的血液置于真空密封的(处于低于大气压的压力下)的第一容器中，所述第一容器任选地包含抗凝血剂；将血液分离成一系列的级分，其中一个级分是具有血小板浓度梯度的血浆级分；将提取设备基本上一直引入到所述第一容器中包含的最高级分的顶部液位；将真空密封的(处于低于大气压并且低于第一容器的压力的压力下)第二容器连接到所述第一容器并且等待一段特定的时间直到所需数量的血浆和/或其它级分由于压力差从所述第一容器被传送到所述第二容器；以及移除所述第二容器。涉及连接第二容器、等待一段时间以及移除第二容器的步骤可以重复进行，以便达到获得一个以上的第二容器的目的(确保提取设备插入的深度被适当调节)，每个所述第二容器包含的组合物具有特别针对将使用该组合物的医学应用的血小板浓度和其它生物学特性。在一个实施例中，所有步骤在一个封闭的系统中执行，容器不会被打开，并且不会执行导致容器的内容物与周围空气发生接触的任何其它行为。在此实施例中，可以在将第二容器连接到第一容器之前在第一容器中任选地插入通风系统(允许吸入少量经过滤的空气)。在另一个实施例中，可以在血液分离成多个级分之后并且在引入提取设备之前打开第一容器，从而简化第二容器的连接以及血浆和/或其它级分的传送，这是因为不需要对具有隔膜/密封垫(Septum)的盖进行穿孔。如果例如此方法在无菌环境例如手术室内的层流室中实施，则在向第二容器传送之前打开第一容器时，此方法在复合物的可能的细菌污染方面是同样安全的。此外，在许多情况下最终的复合物应用在开放的环境下(例如在口部手术或者在处理皮肤溃疡时)，其结果是甚至不需要在无菌环境下实施所述方法。本发明的方法提供了许多有意义的方面并且相对于传统的方法是有利的。首先，本发明的方法不涉及对整个血浆级分或各种整体级分的自动或强制提取。 相反地，本发明的方法允许在无菌条件下根据应用从第一容器提取需要数量的血浆和/或其它级分。换句话说，能够根据所希望的最终产品的特性来提取需要数量的血浆。如前文所述，还可以从单个血液试样(单个第一容器)获得具有用于不同医学应用的不同复合物的若干第二容器。因此所述方法使得血小板的剂量能够个性化，并伴随所提取的一种或多种级分的任何其它要求的生物学特性。这意味着可以针对最终复合物所设计用于的医学应用来定制所述最终复合物。其次，留在第二容器中的产品被储存在密封和无菌的容器中，因此随时可以接受随后的处理进一步处置(例如，添加活化剂，等待一段时间，经受一定温度，进一步进行离心作用，等等)，浸润其它物质或产品，储存，冷冻，等等。根据本发明的方法制造的复合物可以用于各种应用，例如骨再生以及退行性关节病的治疗。在所附的非限制性附图中可以看到本发明的细节-图1和2示出根据本发明的提取设备的一个实施例的示意图，所示出的提取设备分别为组合的和分解的形式。-图3和4分别示出图1的实施例中包含的壳体的完整的和局部的透视图。
要差一些。第一容器的示例本申请人市售的TE5或TE9PRGF 收集管是可以与本发明一起使用的第一容器的两个示例。这两种收集管都是无菌的塑料管，其包括主体和可穿孔的盖并且分别具有5ml和9ml的容积。由特定的医学应用的要求来确定使用哪一种管，并且这两种管均带有标签。 所述标签包括指示容积并且朝着管的底部升高的刻度。这些管包含作为抗凝血剂的3. 8% 的柠檬酸钠浓度，并因此具有以下特性TE5 管容量5ml真空体积(压力)4.5ml柠檬酸钠的体积0. 5ml尺寸13 X 75mmTE9 管容量9ml真空体积(压力)8. Iml柠檬酸钠的体积0. 9ml尺寸16 X IOOmm所述方法的步骤二包括将血液分离成不同的级分，这优选地通过对第一容器进行离心作用进行(在特定的离心速度下并持续一段特定的时间)或者通过将管放置在架子上并等待这些级分由于沉降作用而分离。在对第一容器进行离心作用的情况下，所述离心作用可以具有一系列特定的特性。优选地在100-900G的速度下在3-12分钟的时间上并且在环境温度或者不在环境温度下(即在任何温度下)对第一容器进行离心作用。在这些范围内，如果在300-800G的速度下在5-9分钟的时间上执行离心作用，则是特别有利的。这些离心作用参数范围更清楚地分离了各种级分(具有变化的血小板浓度的血浆，具有血小板的白细胞，红细胞以及可能有的其它级分)。在第一容器中插入通风系统的步骤是任选的。如果不插入通风系统，则血浆和/ 或其它级分将被传送直到医护人员移除第二容器或者直到第一和第二容器中的压力水平变得相等(这取决于第二容器的压力)。然而，如果插入通风系统，该通风系统允许经过滤的空气进入被密封的第一容器，其结果是第一容器的压力总是高于第二容器的压力。结果， 只有当提取设备被移动到最高液位上方或者当然地当第一容器的所有内容物已经被传送到第二容器时，在医护人员移除第二容器的情况下，提取操作才结束。关于所述方法中涉及的以下步骤，即，有关提取设备的插入，第二容器的连接，血浆的一部分或者其它级分向第二容器的提取，以及所述第二容器的移除的步骤，这些步骤和第二容器可以具有一系列特定的特性。所述提取设备基本上一直插入到容纳在第一容器中的最高级分的顶部液位处。如果连续地或按顺序地提取不同级分到一系列的第二容器，则所述提取操作总是涉及抽吸剩余液态的顶部部分。换句话说，随着液位在抽吸期间下降，提取设备的插入总是调节到液体的顶部。因此，如果对于特定的医学应用需要例如提取血浆的底部部分(具有最高血小板浓度的部分)，则首先在一个或多个步骤中提取位于所需要的部分上方的血浆(此血浆包含较低的血小板浓度，可以丢弃或者用于其它医学应用)。在可以提取的级分或者级分的组合方面，本发明提供了无数可能性。以下都是可以提取的仅血浆(该级分的全部或者一部分，其包含可变的血小板浓度或者如果离心作
7用在高速下进行则甚至根本不包含血小板)；仅白细胞，其具有血小板(该级分的全部或者一部分)；仅红细胞(该级分的全部或者一部分)；血浆(该级分的全部或者一部分)连同白细胞(该级分的全部或者一部分)；血浆(该级分的全部或者一部分)连同全部的白细胞级分以及红细胞级分的全部或一部分；或者，白细胞级分的全部或一部分连同红细胞级分的全部或一部分。此外，第二容器保持密封并且至少直到过程结束之前不会打开，从而形成封闭系统或封闭回路，在该封闭系统或封闭回路中血浆以及其它复合物不会与空气发生接触(如同第一容器一样)。一般地，所述第二容器被密封或者盖有带螺纹的或加压的盖。所述盖可以穿孔。第二容器优选地是具有4-50ml容量的圆柱形管。根据最终复合物所设计用于的特定医学应用的要求，第二容器可以任选地包含至少一种凝血剂、前凝血剂(procoagulant)或血小板活化剂。10%的氯化钙浓度通常用作凝血剂，但是也可以设想其它的凝血剂，例如牛凝血酶、人凝血酶、等等。本发明还设想在第二容器中使用促凝剂例如帮助凝结的专用惰性添加剂(硅石等)，以及第二容器由促凝材料 (玻璃)制成。本发明还设想第二容器可以包含所述第二容器中容纳的复合物所设计用于的医学应用所需用的其它生物材料或者试剂。可以在从第一容器进行传送之前(例如在制造第二容器期间)或者一旦完成传送之后，将所述凝血剂、前凝血剂、活化试剂、或者其它生物材料或试剂添加到第二容器中。所述第二容器通常由塑料或玻璃制成。塑料由于其能够延迟凝结过程而对于某些应用是有用的，如果使用不包含凝血剂的第二塑料容器，则效果更明显。第二容器的示例本申请人市售的TF5-EST或者TF9-EST PRGF 血浆级分管是可以与本发明一起使用的第二容器的两种示例。这两种示例都是无菌的塑料管，其包括主体和可穿孔的盖并且各自具有5ml和9ml的容积。由特定的医学应用的要求来确定使用哪一种管，并且这两种管都带有标签。所述标签包括指示容积并且朝着管的顶部升高的刻度。这些管具有不同的负压并且可以根据技术要求制造为具有不同的压力。另外需要指出的是，本发明设想仅执行一次提取操作以便在一第二容器中分离需要数量的至少一种级分以用于特定应用。本发明还设想此步骤可以重复一次以上以便在不同的第二容器中分离血浆的不同部分(具有不同的血小板浓度或者甚至没有血小板)或者其它级分以用于不同的应用。例如，可以提取具有较低的血小板浓度或者不具有血小板的血浆的一部分(管的顶部级分的顶部部分)以用于一种应用，并且可以在稍后的阶段提取具有较高血小板浓度的血浆的一部分(位于更下方，靠近白细胞级分)以用于需要更加富含细胞信号的终端产品的另一种特定应用，从而利用血浆级分的血小板浓度梯度。在下文中给出了解释本发明的提取方法背后的概念的操作示例。操作示例1 将血液置于由塑料制成的不具有抗凝血剂的第一容器中(不使用抗凝血剂的事实意味着在后面的阶段不需要使用凝血剂和活化剂)。在离心作用之后，将整个血浆级分提取到由玻璃制成的第二容器，或者提取到由塑料制成的具有促凝剂的第二容器，由此实现血块凝缩。最终的复合物具有半固体的稠度，因此可以在诸如以下应用中用作纤维素帽或膜口部或上颂面手术中的闭合式缝合之前的颗粒骨移植物的稳定化，以用于拔取后牙槽(post-extraction alveolus)的处理，等等。操作示例2 将血液置于由塑料制成的不具有抗凝血剂的第一容器中(不使用抗凝血剂的事实意味着在后面的阶段不需要使用凝血剂和活化剂)。在离心作用之后，将整个血浆级分提取到由塑料制成的不具有促凝剂的第二容器，因此血浆的凝结被延迟。因而最终的复合物具有液体的稠度，并且可以用于诸如以下应用关节组织再生或者皮下或肌肉注射的浸润， 或者作为生物材料添加以使所述生物材料凝结成块，等等。操作示例3 将血液置于由塑料制成的具有抗凝血剂的第一容器中(因此延迟或阻止凝结)。 在离心作用之后-首先，将血浆的一定量的顶部部分(换句话说，具有较低血小板浓度或者不具有血小板的血浆)提取到由玻璃制成的并且包含氯化钙(凝血剂和活化剂)的第二容器。形成半固体的复合物，其可以在诸如操作示例1中提到的应用中用作纤维素帽。-其次，将第一容器中的剩余血浆的顶部部分(换句话说，相对于此前提取的血浆具有更高的血小板浓度的血浆)提取到由塑料制成的并且包含氯化钙(凝血剂和活化剂) 的另一个第二容器。所述氯化钙也可以在稍后的步骤中添加。形成液体复合物，其可以用于诸如以下应用在骨需要再生的身体部位上与来自患者(可以从该患者获得本方法中使用的血液)的自体颗粒骨混合，以用于皮肤和关节的浸润或任何其它用途。操作示例4 将血液置于由塑料制成的包括抗凝血剂的第一容器中。在离心作用之后，将整个血浆级分提取到具有凝血剂和活化剂的第二塑料容器中。该试剂也可以在稍后的阶段中添加。最终的复合物具有液体的稠度，并且可以用于诸如以下应用关节组织的浸润、皮下或肌肉的浸润，等等。操作示例5 将血液置于由塑料制成的不具有抗凝血剂的第一容器中(不使用抗凝血剂的事实意味着在后面的阶段不需要使用凝血剂和活化剂)。在离心作用之后，打开第一容器并且将整个血浆级分提取到由玻璃制成的第二容器，或者提取到由塑料制成的包含促凝剂的第二容器，从而实现血块凝缩。最终的复合物具有半固体的稠度，因此可以在诸如以下应用中用作纤维素帽或膜口部或上颂面手术中的闭合式缝合之前的颗粒骨移植物的稳定化，以用于拔取后牙槽的处理，等等。本发明的另一个目的是提供一种用于将材料从第一容器提取到第二容器的提取设备。图1和2示出了本发明的提取设备的一个实施例的示意图，所述的提取设备分别为组合的和分解的形式。所述提取设备主要包括将插入根据所述方法的第一容器的第一针2， 将插入根据所述方法的第二容器的第二针4，以及可以由用户操作以打开和闭合材料从第一针2向第二针4的流通的机构。一般地，在所述方法将在密封环境下实施的情况下，换句话说在第一容器被密封的情况下，第一针2具有斜切的末端(因此使得所述斜切的末端能够在第一容器的盖上穿孔)。但是，如果所述方法将在开放环境下实施(通过在第一容器经受离心作用之后打开第一容器)，则第一针2不必需具有斜切的末端。优选地，所述用于打开和闭合材料从第一针2向第二针4的流通的机构是切换单元3，所述切换单元3如图中所示具有按钮3a，使得能够容易和有效地使用所述设备。在所示的实施例中，系统包括用于使第二针4的凸出连接部适配于切换单元3的凸出连接部的连接器6。当然，所述连接器6并非总是需要的。优选地，所述设备还包括壳体1，第一针2从所述壳体1伸出。所述壳体1使得能够操作所述用于打开和闭合材料从第一针2向第二针4的流通的机构。例如，在所示的实施例中，切换单元3的按钮3a从壳体1伸出并且可以由设备的用户容易地操作。优选地，所述壳体1还包括用于接纳(全部或部分地)根据所述方法的第二容器的容纳区域5。所述容纳区域5也可以在图4中看到，图4示出图1所示的壳体1的局部透视图。图3示出整个壳体1的透视图，其中可以看到切换单元3的按钮3a穿过的孔7和第一针2穿过的孔8。壳体1还可包括使得通风系统能够插入的孔以及用于将通风系统引向第一容器的机构。在材料的流通不能由于第一容器和第二容器之间的压力相等而中断的情况下，当本发明的方法在第一容器密封的条件下实施时，允许吸入少量经过滤空气的所述通风系统是有用的。所示的系统如下这样使用将第二容器插入容纳区域5，并且通过在其上施加足够的压力，第二针4能够在所述第二容器的盖上穿孔。然后将第一针2插在第一容器(打开或封闭的)中。然后按压切换单元3的按钮3a，从而材料(根据本发明的方法)由于压力差从第一容器传送到第二容器。


本发明公开了一种用于从血液制备具有生物学特性的至少一种复合物的方法。所述方法在低于大气压的压力的封闭管内实施，以便减少或防止由于处理复合物导致的对复合物的细菌污染。所述方法特别地包括重复以下步骤任何需要的次数将第二真空容器连接到血液取样设备，所述设备继而连接到包含分离成多种级分的血液的第一容器；等待直到所需的级分已经被传送；以及抽回第二容器。可以获得包含用于不同医学用途包括用于生物学治疗的不同复合物的多个第二容器。这些步骤可以在不打开所述容器的情况下在封闭系统内执行，或者可以在血液取样设备被引入之前打开第一容器。