专利名称：用于可结晶成熟型SARS冠状病毒非结构蛋白12(sars-nsp12)的外源重组表达及纯化方法冠状病毒(Coronaviridae/Coronaviruse, CoV)是一类对人及家畜具有严重危害的病原微生物，其中的SARS-CoV在2003年的全球性爆发更是对人类健康和全球经济造成了严重威胁和重大损失。冠状病毒拥有目前已知最大的正链RNA基因组。侵染细胞后，它通过直接翻译与不连续转录-翻译得到一系列病毒蛋白，包括非结构蛋白、结构蛋白与附属蛋白。对于在冠状病毒转录/复制过程中具有重要作用的非结构蛋白与附属蛋白，由于其与目前研究较为深入的蛋白质序列相似性很低，因此系统地开展与冠状病毒转录复制密切相关的蛋白质的结构基因组研究，不仅能够从分子水平深入了解冠状病毒转录复制的分子机制，而且对于有针对性地设计抗冠状病毒的药物具有非常关键的作用。因此，美国、欧洲及我国的多个研究组实施了针对冠状病毒及其相关病原体的结构基因组计划，使人类对冠状病毒蛋白质结构与功能的认识进入了一个新阶段。经过多年的努力，SARS冠状病毒基因组中的大部分蛋白都已经通过X射线衍射技术获得了其三维结构，并先后投入到靶向蛋白的抗病毒药物研发工作中。然而，截止目前，对在冠状病毒转录复制中占有至关重要的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-cbpendent RNA polymerase，RdRP)，却受困于无法获得大量完整成熟态的蛋白，一直无法通过晶体学及X射线衍射技术获知其精细的三维结构。病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)是病毒基因组编码的一类重要的酶，它催化了病毒基因组的复制和转录。由于在宿主细胞中没有类似的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，所以这类聚合酶就成为了抗病毒药物开发的首选靶标。获取蛋白质三维结构对开展针对性的药物设计具有重要帮助，因此揭示RdRP三维结构对开展药物设计以及功能研究都具有重要价值。2009年，北京协和医学院硕士学位论文《SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶原核和真核表达及纯化》(作者张蕾；导师刘力)分别针对原核表达系统和真核系统提及了 SARS冠状病毒非结构蛋白nspl2的两种表达技术方案,对于真核系统表达方案，由于涉及真核细胞的转染和培养，表达体系的构建十分费时费力；蛋白产率很低，必须依靠抗体才能够获得可见检测，无法开展体外活性检测以及结构测定工作；真核表达系统的培养基、耗材、环境控制等带来巨大的成本消耗。对于原核系统表达方案，作者提及了一些体系严重的缺陷:获得表达的蛋白分子在氮端不是蛋白的野生型状态，有多余的氨基酸残基；重组蛋白很不稳定，出现明显的、快速的降解，无法开展结晶和结构测定工作；重组蛋白在活性测定实验中表现的活性很小。总之，在以往的研究中SARS冠状病毒未见在细菌中获得大量稳定的完整蛋白表达和相应纯化，往往都遭遇表达量不足、活性较低以及蛋白极易降解的问题。能够利用原核表达体系(工程细菌)获得高效表达纯化的蛋白对进一步研究nspl2的结构、功能以及开展药物筛选工作具有重要帮助。本发明即是针对于SARS冠状病毒非结构蛋白nspl2设计了一种可以大量获得具有完整成熟形态蛋白分子的方法，在该方法基础上设计了一套针对该蛋白的纯化方法，并进行了酶活力测定和晶体学研究，肯定了所获得的蛋白的天然活性状态。
本发明为解决现有技术方案对SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶nspl2进行重组表达产生的诸多重要问题和缺陷，特别是:目的蛋白产率低、重组表达蛋白生物活性低、重组蛋白理化生性状不稳定且十分容易发生降解的问题和缺陷，提供了将SARS冠状病毒具有正常生物活性的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)-非结构蛋白12号(nspl2)的野生型克隆、重组表达、纯化及结晶的方法。本发明提供了一种重组融合蛋白及其编码核酸序列，所述重组融合蛋白包含小泛素样修饰蛋白SMT3活性片段、nspl2和多聚His标签。其中SMT3活性片段优选为SMT3的1-98氨基酸片段，该SMT3片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其中nspl2的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。所述重组融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。 所述的重组融合蛋白的编码核酸序列如SEQ ID N0:4所示。还包括含有上述核酸序列的重组表达载体，以及含有所述重组表达载体的宿主细胞。还提供了一种具有野生态氮端的nspl2的制备方法，包括将上述的核苷酸序列与原核或真核表达载体可操作性的连接，得到重组表达载体1，将该重组表达载体1，以及表达类泛素蛋白加工酶Ulplp、其活性片段或与其有相同功能的蛋白酶(如SARS冠状病毒非结构蛋白nsp3)的重组表达载体2依次或同时转化到宿主细胞中，然后诱导蛋白表达，上述的核苷酸序列编码的融合蛋白在宿主细胞体内完成修饰，生成具有野生态氮端的nspl2。该方法还可包括纯化步骤。所述纯化步骤优选为:超声波或者其他裂解方法裂解宿主细胞，离心取上清过Ni Sepharose 6Fast Flow亲和柱,过柱后洗脱液可进一步经离子交换层析和凝胶过滤层析提纯。其中类泛素蛋白加工酶Ulplp活性片段为类泛素蛋白加工酶Ulplp的403-622氨基酸片段。其中用于构建所述重组表达载体I的表达载体为pET26b或其他本领域普通技术人员可以共识为具有同种功能的载体，用于构建所述重组表达载体2的表达载体为pET-1 Ia或其他本领域普通技术人员可以共识为具有同种功能的载体。其中所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS。—方面,在一具体实施方案中，本发明提供了 SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)-非结构蛋白 12 号(nspl2)的野生型基因的克隆及表达质粒的构建。本发明述及通过向nsp 12氮端引入小泛素样修饰蛋白，羧基端引入组氨酸标签，形成有助于nspl2蛋白表达，有助于形成目的蛋白野生型氮端，同时便于后续纯化工作的重组蛋白表达方案。所述方法通过将小泛素样修饰蛋白基因(Saccharomyces cerevisiae S288c Smt3p (SMT3)mRNA 1-291)、nspl2 基因(SARScoronavirus BJOI, complete genome positions I3Ill-159O3)连入 pET_26b 载体实现，形成 pET26b-S-nspl2-CHis6 表达质粒。另一方面，在一具体实施方案中，本发明提供了用于切除nspl2氮端多余氨基酸残基形成野生态的蛋白酶的表达质粒的构建。所述方法通过将类泛素蛋白加工酶(Saccharomyces cerevisiae S288c Ulplp (ULPl)mRNA1207_1866)连入 pETlIa 载体中实现，形成pET-1 Ia-Ulp表达质粒。另一方面，在一具体实施方案中，本发明提供了重组nspl2蛋白在原核系统表达并自动形成具有野生型氮端蛋白的方案。本发明述及将上述PET-26b-S-nspl2-CHis6表达质粒和pETlla-Ulp表达质粒同时转入原核表达系统用大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中实现。本发明述及优选使用大肠杆菌的原核细胞表达系统对上述蛋白进行表达，但不排除其他的表达系统，如在其他细菌中或者其他真核生物细胞中进行表达。另一方面，在一具 体实施方案中，本发明提供了对于具有野生型氮端和羧基端组氨酸标签(HisX6)的nspl2蛋白的纯化方法。述及通过亲和柱、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法分离纯化获得nspl2蛋白，并最终用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。另一方面，在一具体实施方案中，本发明提供了一种结晶上述得到的nspl2蛋白的方法。所述方法包括:将所述的nspl2蛋白浓缩至5-30mg/ml ;在4_30摄氏度用气相悬滴法筛选晶体生长条件，获得了该蛋白的晶体。另一方面，在一具体实施方案中，本发明提供了一种检测上述得到的nspl2蛋白的生物活性(RNA聚合酶活性)检测方法。本发明提供的野生型nspl2蛋白克隆、重组表达、纯化方法能够有效克服既有技术方案的缺陷，主要的有益效果包括:本发明提供的表达方法能够以约每升培养基Img蛋白的产率产生目的蛋白nspl2 ；本发明提供方法获得表达的nspl2蛋白具有野生型一级结构，特别是其氮端氨基酸残基完全与野生型相同，保证了目的蛋白的理化生稳定性；本发明提供方法获得表达的nspl2蛋白具有稳定的理化生稳定性，没有发生既有技术方案中出现的明显降解情况；本发明提供方法获得表达的nspl2蛋白经过必要的纯化处理，能够用于结晶实验，并可以形成蛋白质晶体。本发明提供方法获得表达的nspl2蛋白，经过公认可靠的同位素检测体系，证明具有野生型应具有的正常的RNA聚合酶生物学活力。图1:pET-26b-S-nspl2-CHis6 质粒表达产物结果。图2:nspl2蛋白晶体。图3:nspl2蛋白晶体X射线衍射分析结果。图4:nspl2蛋白的RNA聚合酶活性同位素方法检测结果。


本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。


本发明通过将小泛素样修饰蛋白基因、nsp12基因连入pET-26b载体实现，形成pET26b-S-nsp12-CHis6表达质粒；还通过将类泛素蛋白加工酶连入pET11a载体中实现，形成pET-11a-Ulp表达质粒，然后将上述pET-26b-S-nsp12-CHis6表达质粒和pET11a-Ulp表达质粒同时转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中实现nsp12的野生型蛋白的表达、纯化，获得的nsp12的野生型蛋白具有野生型应具有的正常的RNA聚合酶生物学活力，而且其在经过必要的纯化处理，能够用于结晶实验，并可以形成蛋白质晶体。本发明提供了用于可结晶成熟型SARS冠状病毒非结构蛋白12(sars-nsp12)的外源重组表达及纯化方法。