专利名称：矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法矮牵牛(PetuniaXhybrida Vilm.),别名灵芝牡丹、碧冬爺、撞羽朝颜等，为爺科(Solanaceae)矮牵牛属花丼。矮牵牛为多年生草本双子叶植物，常作一、二年生栽培，株高15 80cm不等；叶片呈现椭圆或卵圆状；营养生长期短，当年可开花，花期可长达数月之久；花冠呈现喇叭状(类似牵牛花)；花瓣边缘类型有平瓣、波状瓣、锯齿瓣等；花色有紫、红、白、 粉及镶嵌、网纹、条纹等；果实为尖圆形蒴果，种子极小，千粒重约0. Ig (费砚良，刘青林，葛红等.中国作物及其野生近缘植物，花卉卷[M].中国农业出版社，2008:505-508)。矮牵牛原产于南美洲的阿根廷，目前在世界各国均广泛种植，如日本、意大利、法国、西班牙、荷兰和德国等，用于道路街边绿化和庭园美化；在美国，矮牵牛的种植面积和消费额高居草本花卉之首；在日本，矮牵牛也被评为最受欢迎的草本花卉之一。矮牵牛广泛应用于花坛、花境布置，窗台和庭院装点，另外大花、重瓣的品种也是切花的材料。矮牵牛种子常规保存寿命3-5年，发芽率60%左右，染色体倍数为2X、4X、5X(X=7)类型。矮牵牛品种在种植时退化现象严重，很多品种只能通过无性繁殖保存种质。我国目前矮牵牛种子多为国外进口的杂交种，其价格十分高昂，虽可以采用扦插繁殖，但其成活率低，但是实际生产中需要大量的种苗，很难在短时间内提供大量的繁殖体。目前，有关矮牵牛的种质保存方面的研究报道较少。超低温保存技术是可长期安全保存种质资源的可选择的较佳途径之一，不但节约空间，而且成本低。现已开发出多种超低温保存方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同栽培品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同，迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的一个主要瓶颈。
本发明的目的是提供一种矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及植株再生培养方法。为了实现本发明目的，本发明的一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温(_196°C )冷冻保存的步骤。材料扩繁具体步骤如下1)将矮牵牛试管苗接种在含0. 5mg/L BA和30g/L鹿糖的MS固体培养基上进行扩繁；2)将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2°C，光照14h/d，光照强度为7001ux。茎尖剥取具体为在无菌条件下，从继代15-20d的生长健壮的矮牵牛无菌苗上剥取带2-3片叶原基，直径大小约2 3mm的离体茎尖为材料。预培养具体为将剥取的茎尖在含0.2、. 4mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25°C振荡预培养f 3d，摇床转速为60rpm/min。装载具体为将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载2(T40min ;所述装载液的组成为MS+2mol/L甘油+0. 4mol/L鹿糖。PVS2脱水处理具体为将装载后的茎尖置于PVS2中，(TC处理3(T50min ;所述PVS2的组成为MS+30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亚砜+0. 4mol/L蔗糖。超低温冷冻保存具体为将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。本发明进一步提供利用上述方法获得的矮牵牛离体茎尖在组织培养及植株再生中的应用。其包括解冻、洗涤及恢复再生培养的步骤。具体为将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，迅速投入卸载液中解冻并洗涤，然后将茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2°C下暗培养7d，最后移至光下培养。洗涤次数优选为2 3次，每IOmin更换一次卸载液。所述卸载液的组成为MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢复再生培养基的组成为MS+0. 5mg/L BA+30g/L 蔗糖 +9. Og/L 琼脂。本发明的矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存及植株再生培养方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50%以上。图I为本发明实施例I中不同品种矮牵牛超低温保存后的存活率和再生率比较。图2为本发明实施例I中超低温保存后矮牵牛茎尖恢复培养的结果；其中a-e为恢复培养20d，a.存活率和再生率分别为25%和16. 67% ；b.存活率和再生率分别为75%和66. 67% ；c.由茎尖直接再生的带根小苗；d.茎尖直接再生的不带根小苗；e.恢复培养存活但不能再生；f.恢复培养14d，存活的茎尖，只有上部分生组织和叶原基存活；g.恢复培养10d，存活的茎尖；h.恢复培养10d，死亡的茎尖。图3为本发明实施例2的预培养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。图4为本发明实施例3中预培养时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。图5为本发明实施例4中装载时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。图6为本发明实施例5中PVS2处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。图7为本发明实施例6中利用引物PID3H7对矮牵牛(牛2)组培苗进行SSR扩增的结果；其中，a中各泳道为未经超低温保存的试管苗叶片DNA扩增图谱，b中各泳道为经过超低温保存的再生苗叶片DNA扩增图谱，*为对照处理的样品。
实施例I矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及植株再生培养方法实验材料矮牵牛(PetuniaXhybrida Vilm.) “泛美梦幻”系列4个品种试管苗牛I (白色)、牛2 (蓝色)、牛3 (红色)、牛4 (玫瑰红色)。实验方法具体步骤如下I、材料扩繁I)将矮牵牛试管苗接种在含0. 5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固体培养基(含9. Og/L琼脂)上进行扩繁；
2)将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2°C，光照14h/d，光照强度为7001ux。2、茎尖剥取在无菌条件下，从继代15-20d的生长健壮的矮牵牛无菌苗上剥取带2-3片叶原基，直径大小约2 3mm的离体茎尖为材料。3、预培养将剥取的茎尖在含0. 2mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25°C振荡预培养2d，摇床转速为60rpm/min。4、装载将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载30min ;所述装载液的组成为MS+2mol/L 甘油 +0. 4mol/L 鹿糖。5、PVS2脱水处理将装载后的茎尖置于PVS2中，(TC处理30min ;所述PVS2的组成为MS+30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亚砜+0. 4mol/L蔗糖。6、超低温冷冻保存将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将载有包裹着茎尖的PVS2小滴的铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻过的小滴连同铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮(_196°C )中进行保存。7、解冻、洗涤将液氮保存的离体茎尖取出，迅速投入卸载液中解冻并洗涤2次，每IOmin更换一次卸载液。其中，卸载液的组成为MS+1.2mol/L蔗糖。8、恢复再生培养将洗涤后的茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2°C下暗培养7d，最后移至光下培养。其中，恢复再生培养基的组成为MS+0. 5mg/LBA+30g/L蔗糖+9. Og/L琼脂。不同品种矮牵牛的存活率和再生率如图I所示。超低温保存后茎尖恢复培养的结果如图2所示，其中a-e为恢复培养20d，a.存活率和再生率分别为25%和16. 67% ；b.存活率和再生率分别为75%和66. 67% ；c.由茎尖直接再生的带根小苗；d.茎尖直接再生的不带根小苗；e.恢复培养存活但不能再生；f.恢复培养14d，存活的茎尖，只有上部分生组织和叶原基存活；g.恢复培养10d，存活的茎尖；h.恢复培养10d，死亡的茎尖。实施例2预培养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低温保存的影响
仅改变预培养液中的蔗糖浓度，其余步骤同实施例I，研究预培养液中蔗糖浓度对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图3所示。从图3可以看出，矮牵牛茎尖经小滴玻璃化法超低温保存后，其存活率和再生率对预培养液中蔗糖浓度的变化较为敏感。随着预培养液中蔗糖浓度的上升，茎尖存活率和再生率呈现先上升再下降的趋势，过高或过低浓度的蔗糖均可能导致存活率和再生率下降，其中含0. 2^0. 3mol/L蔗糖的预培养液的效果较好，存活率和再生率高达80%和70%以上，与经其他浓度的蔗糖预处理后茎尖的存活率和再生率差异显著。
实施例3预培养时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响仅改变预培养的时间，其余步骤同实施例1，研究预培养时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图4所示。从图4可以看出，矮牵牛茎尖经小滴玻璃化法超低温保存后，其存活率和再生率对预培养时间变化较为敏感。预培养时间从Od延长至2d时茎尖存活率和再生率缓慢提高，预培养2 3d时茎尖存活率和再生率最高，达80%和70%以上。预培养3 5d茎尖存活率和再生率下降。实施例4装载时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响仅改变装载的时间，其余步骤同实施例1，研究装载时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图5所示。从图5可以看出，采用小滴玻璃化法对矮牵牛茎尖进行超低温保存，其存活率和再生率对装载时间长短敏感。装载时间由Omin延长到20min时茎尖存活率和再生率显著升高，装载2(T40min时茎尖存活率和再生率最高，存活率和再生率高达80%和70%以上，装载超过40min茎尖存活率和再生率下降。实施例5PVS2处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响仅改变PVS2脱水处理的时间，其余步骤同实施例1，研究PVS2脱水处理时间对矮牵牛茎尖超低温保存的影响。结果如图6所示。从图6可以看出，矮牵牛茎尖小滴玻璃化法超低温保存对PVS2处理时间长短较为敏感。PVS2处理时间由Omin延长到30min时茎尖存活率和再生率显著升高，PVS2处理30min时茎尖存活率和再生率最高，达80%和70%以上。PVS2处理超过40min茎尖存活率和再生率下降，即过短或过长时间的PVS2处理均可能导致存活率和再生率的下降。实施例6超低温保存处理对再生的矮牵牛遗传稳定性的影响将牛2的一株试管苗扩繁获得100株试管苗，并进行连续编号。当苗龄为20d时剥取茎尖，按照实施例I的小滴玻璃化法程序(步骤f步骤6)进行超低温保存(对每株试管苗进行编号，剥取茎尖也做相应的编号，每个茎尖的超低温保存独立进行)。剥离茎尖同时，提取100株试管苗叶片的DNA以备用。茎尖经过小滴玻璃化法的超低温保存后再生了 60个试管苗，提取其叶片DNA。以超低温保存前剥取茎尖的相同编号的试管苗叶片DNA为对照，共120份样品采用SSR分子标记进行遗传稳定性检测。经过PCR扩增体系的优化以及PCR扩增条带的筛选，最后选用15对引物进行SSR扩增(退火温度490C 55°C )，PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。超低温保存前的60个组培苗没有出现差异性条带；超低温保存后的60个再生苗也没有出现差异性条带，且条带模式与超低温保存前相同。例如，利用引物PID3H7进行SSR扩增。PID3H7引物序列及退火温度如表I所示表1PID3H7引物序列及退火温度


本发明提供了一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温冷冻保存的步骤。通过对采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术获得的矮牵牛离体茎尖进行植株再生培养，表明该法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50%以上。