专利名称：一种水溶性α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取方法药用真菌是一类具有较高药用价值的高等真菌，普遍具有抗肿瘤、降血糖、降血 脂、抗病毒和增强免疫力等几种或多种功效。随着现代社会发展，不良生活和工作方式增多，人口老龄化不断加剧，近二十年 来，我国糖尿病的发病率一直呈迅速上升趋势，据2010年的一份最新科学报道，我国现有 糖尿病患者高达9400万人，已取代印度成为全球糖尿病人数最多的国家，而且，我国还有 1.48亿尚不构成糖尿病诊断的糖代谢异常患者(糖尿病前期患者)。糖尿病可以导致心脏 病、高血压、肾衰竭、失明、下肢溃疡或坏死等多种并发症，从而使患者残疾或死亡，已经成 为仅次于肿瘤和心血管疾病的“第三号杀手"，在我国仅相关医疗费用每年就数以千亿计。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种因体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引 起的碳水化合物、脂肪、蛋白质、水、电解质紊乱的慢性内分泌代谢疾病，与遗传因素以及多 种环境因素相关。其典型表现以多饮、多食、多尿、消瘦这“三多一少”和血糖增高为特征， 属于中医的“消渴”范畴。目前，对于I型糖尿病的治疗，研究方向是开发给药方便、有效的胰岛素制剂及代 用品。而对于II型糖尿病的治疗，不能单存依靠补充胰岛素，还需口服降糖药如胰岛素促 泌剂(如磺酰脲类)、胰岛素增敏剂(如噻唑烷二酮类)、葡萄糖代谢增强剂(如双胍类)和 α -葡萄糖苷酶抑制剂(如目前临床上已应用的阿卡波糖Acarbose、伏格列波糖Voglibose 和米格列醇Miglitol，其主要降糖机理是对小肠α-葡糖甘酶起一种竞争性、剂量依赖性 的抑制作用，从而阻止不易吸收的多糖化合物转变成易吸收的单糖)。这些化学降糖类药物 尽管见效较快，但对肝、肾等脏器损害较大，某些降血糖药物可使血糖降至正常范围以下， 甚至有发生低血糖的危险。一般这类抗高血糖药物仅仅只是降低异常升高的血糖，对于糖 尿病患者起到治标不治本的作用，而纯天然提取物一般具有作用温和、毒副作用小等优点， 开发利用潜力巨大。已有研究表明桦褐孔菌、虫草、灵芝、姬松茸、灰树花、黑木耳、猴头菌、金耳和香菇 等食药用菌均有一定程度的降血糖功效。其中降血糖作用的成分主要有多糖、皂苷、萜类、 黄酮、生物碱等多种化学结构类型。桦褐孔菌(Inonotus obliquus (Pers. :Fr. )Pil0t)，是珍稀的大型药用真，别名白 桦茸，系担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属药用真菌，是生长在寒带的 木腐菌。主要分布在北半球北纬45° -50°的地区，如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西 西伯利亚、远东部分地区、勘察加半岛)、日本(北海道)、中国(黑龙江、吉林省长白山地 区)。生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上。16世纪至今， 俄罗斯、波兰、芬兰等国家民间就广泛应用桦褐孔菌防治各种癌症(胃癌、肝癌、肠癌等)、心脏病、糖尿病。另外据报道桦褐孔菌可以抑制AIDS病毒的繁殖，1955年莫斯科医学院宣 布桦褐孔菌为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发；日本的研究人员对桦褐孔 菌也给予高度评价，并应用于防治肝癌、艾滋病和0-157大肠杆菌中毒。在桦褐孔菌的降血糖研究方面。1999年日本的Mizimo T等人研究发现，桦褐孔 菌的菌丝和菌核中的多糖有降低血糖的作用，水溶性和非水溶性多糖对糖尿病小鼠都有降 血糖作用，活性成分主要是葡聚糖、杂多糖和蛋白复合物，菌丝多糖并没有明显抗酶特 性，但在给小鼠注射桦褐孔菌菌丝和菌核中提纯的多糖后其降低血糖作用维持了 3 48h， 作用机制还有待进一步研究。2000年，韩国的Siin Y. S.等人从桦褐孔菌分离到的一个新 的含内酯支链的羊毛留醇三萜也具有降血糖作用。2005年，韩国的Yang B. K.等人研究发 现相比对照组，糖尿病小鼠口服桦褐孔菌菌丝体可减少23. 的血糖浓度。2006年，韩国 的Cha，Jae-Yoimg等人发现桦褐孔菌发酵物可降低糖尿病小鼠的血糖水平。Mizimo T等 从桦褐孔菌菌核和菌丝体中提取和部分纯化得到含蛋白的多糖。实验表明可溶和不可溶 性多糖均有降血糖的作用。其有效成分为葡聚糖、杂多糖及它们的蛋白质复合物。另 外，桦褐孔菌发酵物中的成分不仅能有效控制血糖，而且没有任何毒性，因此能有效预防和 治疗糖尿病。国内对桦褐孔菌抗糖尿病的研究较晚，2008年，延边大学的张香花等人的研究 表明桦褐孔菌提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的胰岛、肝和肾组织损伤病变有一定 的保护和修复作用。2008年，江南大学的孙军恩研究发现桦褐孔菌发酵菌粉及其多糖提取 物具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化能力。而且桦褐孔菌发酵菌粉及其多糖组分可能降 糖机理包括修复糖尿病小鼠受损胰岛β细胞、促进胰岛素分泌、增加肝糖原含量和提高糖 尿病小鼠抗氧化能力。2009年，天津大学的卢雪明等人采用用乙醇回流提取、梯度萃取得 桦褐孔菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，对其进行黄酮和多酚类化合物的含量测 定，并测定了总还原力、清除DPPH自由基、抑制肝脂质过氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性四 种体外模型对不同提取物活性的影响，结果显示乙酸乙酯和正丁醇提取物所含的黄酮和多 酚类化合物较多且抗氧化和α-糖苷酶活性较好。桑黄Wiellinus linteus，别名火木层孔菌、针裂蹄(裂蹄)孔菌，属于担子菌亚 门，层菌纲，多孔菌目、多孔菌科、针层孔菌属的药用真菌。桑黄主要寄生于杨、柳、白桦、栎、 榉、桃等阔叶树的枯立木及树干上，因其着生树种不同，分为桑树桑黄、杨树桑黄和桦树桑 黄等品种。国内主要分布于河北、山西、内蒙古、吉林、台湾、四川、陕西、宁夏、甘肃、青海、云 南、黑龙江、新疆、浙江、河南、广东等地，国外主要有韩国、日本、菲律宾、澳大利亚、北美、中 南美等国家。桑黄的药用最早记载于《本草纲目》中。桑黄味微苦，能利五脏、软坚、排毒、止血、 活血等。《神农本草经》中认为桑黄“久服轻身不老延年”。《药性论》记载，桑黄味微苦，性 寒，在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经。现 代药理研究表明桑黄具有抗肿瘤、增强免疫、保肝护肝、抗突变、抗氧化、抗衰老等功能，尤 其在抗肿瘤作用方面作用显著。已有研究表明桑黄中的活性物质主要有多糖、黄酮、留体和 萜类成分。而桑黄在抗糖尿病和降血糖方面的研究报道较少见，仅见2001年韩国的Kim D.H.等人用桑黄菌丝体胞外多糖饲喂链脲霉素导致的糖尿病大鼠，结果显示桑黄多糖能 够降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨酸转氨酶。以及2010年，韩国的Kim4H.M.等人采用桑黄菌丝体多糖能抑制自身免疫诱导的非肥胖小鼠糖尿病的发病率和降低 血糖浓度，发现机理主要是通过调节细胞因子表达起作用。在桦褐孔菌、桑黄两种菌的抗糖尿病、降血糖和α -糖苷酶抑制剂专利方面。天津大学的陈海霞和卢雪明可作为α -葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制 备方法，CN200810152916. 3 ；该专利中桦褐孔菌采用80 %乙醇提取浸膏经适量水分散，石 油醚萃取去杂后的乙酸乙酯萃取部分，再经浓缩干燥后得到了 α -葡萄糖苷酶抑制活性较 高的部分，该部分400 μ g剂量时抑制率达80.5%,半抑制率IC50为103. 9 μ g/mL。广西的卢昶年，卢照凯桑黄白桦茸的复合提取物、其制备方法及其制剂， CN200710048738. 5 ；该专利采用桑黄、桦褐孔菌两者粉碎粉末按一定比例的混合物经两次 热水提取后的混合液，采用三氯醋酸、碱式醋酸、氢氧化隔和氯仿-异丙醇等去除蛋白和杂 质，进行浓缩干燥后得到了复合提取物。该发明的复合提取物经67名患者服用，发现制剂 具有降低血糖、抗癌、抗炎、抗氧化、增强免疫力和保护肝脏等功效。黑龙江的俞文俊一种保健饮料，CN200710072197. X ；该保健饮料由50 90%白 桦茸提取液、5 40%的桑黄提取液、5 15%的刺五加提取液按体积百分比组成。经42 位饮用者服用，发明者认为该保健饮料能够预防癌症、糖尿病、高血压和高血脂等病证。北京的付茂康治疗糖尿病的口服药，CN200710111594. 3 ；该发明中桦树茸 20-80、破壁灵芝孢子粉20-80按原料药重量配比制成。所述灵芝孢子粉是激光破壁孢子 粉，所述桦树茸是粉碎后的桦树茸粉。经几位患者服用，发明者认为该混合粉剂能用于治疗 心脏病、血压高、肝炎和肝腹水等疾病。另外在桦褐孔菌多糖提取的发明专利方面，吉林的崔基成一种桦褐孔菌多 糖提取方法，CN02109803.4。黑龙江的马宏达等人一种桦褐孔菌多糖的提取分离方 法” CN200810137490. 4。上述两专利均未涉及α-糖苷酶抑制活性。在桑黄方面，未发现有桑黄作为α-糖苷酶抑制剂的专利报道，在提取物降血糖 方面，上海的杨焱等人一种桑黄提取物及其制备方法，CN200810201798. 0。采用桑黄子实 体经醇提和水提物两部分混合，经小鼠试验发现该提取物具有明显的降血糖作用，可用于 制备降血糖药物。综上所述，CN200810152916.3、CN200710048738. 5 和 CN200810201798. 0 三个专 利与本发明专利相关度比较高，但是专利CN20081015^16. 3是桦褐孔菌的醇提物，而且 经过了石油醚和乙酸乙酯等对人体有害的有机溶剂萃取。专利CN200710048738. 5是桦 褐孔菌、桑黄两种混合药用真菌的水提物，但同样在实例实施中采用有害的氯仿-异丙 醇等除去蛋白质等杂质，应用安全性较低，而且未直接涉及α-糖苷酶抑制功能，专利CN 200810201798. 0是桑黄的醇提物和水提物两者混合物，且在醇提之后进行水提，在功能上 未直接涉及α-糖苷酶抑制功能。
本发明是根据某些药用菌疗效显著、毒副作用小的特点，提供一种从桦褐孔菌和 桑黄两种药用真菌中提取得到安全性高、α -糖苷酶抑制活性强的水溶性抑制剂的方法，以 期应用于相关的糖尿病人降血糖类医药保健产品。本发明采用的技术方案是一种水溶性α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取方法，所述方法包括以真菌子实体为 原料，粉碎后加入质量为所述子实体质量20 40倍的水，超声处理(20 50ΚΗζ)20 40 分钟后，按照100 200U/g子实体添加量加入高温α -淀粉酶，升温至沸腾提取2 4小 时，离心去渣、取上清液浓缩至原有体积的1/10 1/15(真空浓缩，控制压强0. OSMpa以 下，温度45°C 60°C )，加入乙醇(可加入无水乙醇或95%乙醇)至乙醇终浓度为70 80%，醇沉8 M小时、取沉淀加入质量为沉淀质量(湿重)100 200倍的蒸馏水复溶， 然后以10000截留分子量的膜超滤12 M小时、取滤液浓缩至原有体积的1/40 1/80， 干燥(冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥)，即得所述水溶性α -葡萄糖苷酶抑制剂；所述子 实体来自样揭孑L菌(Inonotus obliquus (Pers. Fr.)Pilcit)或桑黄(Phellinus linteus)。 经检测，按照本发明方法，桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌多糖含量为20 30%，桑黄提取物 中桑黄多糖含量为40 50%，多糖含量可采用苯酚-硫酸法测定。为使有效成分能够被充分提取，所述真菌子实体需粉碎至60 100目。本申请发明人在多种食药用菌子实体对比和多种工艺探索的前提下，得到了本发 明方法，本发明通过超声前处理，淀粉酶酶解，热水浸提，乙醇沉淀后复溶，超滤去杂，喷雾 干燥、冷冻干燥或真空干燥等技术方法，建立了一种安全性高、活性强的药用菌α -糖苷酶 抑制的制备方法和工艺。本发明专利的两种药用真菌水溶性α -糖苷酶抑制剂的制备工艺与常规的食药 用菌多糖提取工艺有些类似，在制备过程中，除乙醇沉淀外，未使用其它有机溶剂，但与常 规多糖提取工艺不同的是提取过程中加入淀粉酶，尽量除去潜在的淀粉类或其它α-糖 苷类物质对α -糖苷酶抑制的影响，另外超声前处理能破碎原料组织，不仅使酶解作用更 充分，也有利于后续的有效物质提取，此外，使用超滤除去1万以下的寡糖或低聚糖类及其 它杂质。糖苷酶抑制活性实验在试管中依次加入1. 2mL磷酸钾缓冲液(0. 067mol/L磷酸 钾缓冲液，pH = 6. 8),50 μ L谷胱甘肽(lmg. mL—1)，2 μ L α -葡萄糖苷酶(0. 1U. mL—1)和一 定体积的两种药用真菌α-糖苷酶抑制剂溶液，37°C保温10分钟。加入50 μ L PNPG，再于 37°C保温10分钟后，加入IOmL碳酸钠终止液，在400mn处测定吸光值。以不加抑制剂作为 空白对照，以阿卡波糖为阳性对照。α -葡萄糖苷酶活力单位定义ρΗ6. 8，37°C条件下，每分钟释放1 μ moIPNP为一个 活力单位。抑制剂活力单位定义pH6.8，37°C条件下，使一个酶活力单位失活为一个抑制剂活力单位。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式为抑制率(酶活力-抑制剂活 力)/酶活力X100%。本发明的有益效果主要体现在采用本发明方法，可获得具有较好活性的水溶性α -葡萄糖苷酶抑制剂，原料桦 褐孔菌和桑黄是两种已有较远应用历史的药用真菌，毒副作用较少，而且本发明采用的工 艺过程不涉及有毒有害步骤，安全性高，十分有利于后续医药保健食品的开发。
本发明提供了一种水溶性α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取方法药用真菌子实体(桦褐孔菌，桑黄)→粉碎过筛60～100目→称取一定量→加入20～40倍重量的水→超声处理20～40分钟→加入液态高温淀粉酶，沸水提取2～4h→3800g以上离心去渣→上清液真空浓缩至原有体积的1/10～1/15→加入食用级乙醇至终浓度80％，醇沉8h以上→沉淀加蒸馏水复溶→1万截留分子量膜超滤12～24h→滤液真空浓缩→冷冻干燥提取物(药用真菌水溶性α-葡萄糖苷酶抑制剂)。采用本发明方法，可获得具有较好活性的水溶性α-葡萄糖苷酶抑制剂，原料桦褐孔菌和桑黄是两种已有较远应用历史的药用真菌，毒副作用较少，而且本发明采用的工艺过程不涉及有毒有害步骤，安全性高，十分有利于后续医药保健食品的开发。