专利名称：一种鱼红细胞氧化应激模型的建立方法自由基(单态氧、超氧阴离子、羟自由基)所造成的氧化损伤是鱼体健康水平下降和多种疾病的诱因。同时自由基能直接对肌肉组织的生物大分子如核酸，蛋白质、脂类造成损伤，降低鱼产品品质。因此，研究鱼类氧化损伤和抗氧化机制，提高鱼体抗氧化能力，对鱼类健康养殖，保证鱼产品品质非常重要。红细胞具有維持内环境稳定、运输、调节、防御等重要功能。但红細胞所处的环境经常与自由基接触。红细胞富含不饱和脂类及铁，其中铁离子是自由基反应的催化剂。因此，红细胞极易受到自由基损伤。一方面损伤膜上的酶和受体，另ー方面破坏膜结构，造成功能酶的有序排列紊乱。红细胞氧化损伤会导致其形态上出现棘形、球形等变化，并最终发生細胞破裂、溶血。红细胞的抗氧化系统可以有效保护红细胞免受自由基损伤，保证红細胞的结构和功能正常。由于红細胞的这ー些特性以及红細胞易于获取和制备，使之成为研究氧化损伤的最佳模型。现有技术中，目前还未见关于鱼类红细胞氧化应激模型建立方法的研究报道。因此根据鱼类红細胞的生理生化特点，摸索建立鱼类红细胞氧化应激模型，对于研究鱼类的抗氧化机制，筛选有效的生物抗氧化物质，提高鱼类的抗氧化能力非常必要。但直接使用现有的陆生动物红细胞氧化应激模型的技术和方法来建立鱼类红细胞氧化应激模型，面临下列难题(1)离心是从血液中分离红細胞的主要方法，但现有方法主要用于的陆生恒温动物，如鼠、猪等，对于鱼类等水生变温动物并不完全适用。首先，鱼类红細胞结构与陆生动物相比存在明显差异，鱼类红细胞与白細胞一祥都具有細胞核，细胞较大，而陆生动物红细胞没有細胞核，较白細胞小。因此，现有的离心參数不适用于鱼类红细胞的分离。需要筛选适用于鱼类红细胞分离的离心參数。其次，鱼类的血液PH和渗透压与陆生动物相比，存在差异。因此，分离鱼类红细胞所用生理盐水的PH和滲透压须调整。(2)现有技术经常用建立细胞氧化应激模型。H2O2除了自身具有氧化作用外， 也可导致· OH大量形成，加剧蛋白质及脂质的氧化损伤，模拟氧化环境。但H2O2在細胞培养液中代谢较快，浓度不稳定，造模效果的可控性较差。利用I^eSO4和1 反应模拟体内产生较稳定的· OH浓度，可提高氧化模型的可控性。
本发明要解决的技术问题是提供一种简便有效的鱼类红细胞氧化应激模型建立方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种鱼红细胞氧化应激模型建立方法，依次包括以下步骤Al、按常规方法将体重相近的3尾鲤鱼尾部消毒，用注射器从每尾鱼尾部抽取约1 毫升血液。A2、将血液放入6毫升含肝素钠(40IU/ml)的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4°C下离心10分钟，弃去上清液。A3、红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4°C下离心10分钟。A4、用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，按步骤A3洗涤2次后，細胞沉淀悬浮在 6毫升鲤鱼生理盐水中，4°C保存备用。A5、取适量的红细胞悬液，加入等体积的1 2+/ 混合溶液，其终浓度为 40yM/20yM，37°C孵育 8-10 小时。Α6、样品在1000g，4°C条件下离心3分钟，细胞样用流式細胞仪和琼脂糖凝胶电泳測定凋亡情況。优选的，所述的方法，所述步骤A2和A4中，所述鲤鱼生理盐水(mmolじ1)组成如下=NaCl, 141. 1 ；KCl, 1. 43 ；CaCl2,0. 99 ；NaHCO3, 2. 64 ；glucose, 6. 16 ；渗透压为 280mos mol じ1，pH 为 7. 9。优选的，所述的方法，所述步骤A5，氧化应激的最适孵育时间为9小吋。与现有技术相比，本发明的鱼红细胞氧化应激凋亡模型建立方法具有以下明显的优点1、本发明首次使用1 2+/ 混合溶液为自由基· OH的来源，建立红细胞氧化应激模型。2、本发明根据鱼类红细胞特点确定了离心分离的关键參数。3、Fe2VH2O2混合溶液的最佳使用浓度和适宜孵育时间。4、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行红細胞分离和氧化应激的研究人员，比较顺利的完成鱼类红細胞分离和氧化应激模型的建立。图1不同剂量1 2+/ 使培养液产生· OH的浓度。1 2+/ 混合液可以稳定产生· OH0图2不同浓度1 2+/ 诱导的鲤鱼红细胞凋亡。Fe2VH2O2浓度为40 μ Μ/20 μ M时， 红细胞的凋亡率达到最大。图3不同时间40 μ Μ/20 μ M Fe2VH2O2溶液诱导鲤鱼红细胞凋亡的DNA碎片裂分折。结果表明孵育时间为9小时时，红细胞的凋亡率达到最大。


本发明公开了一种鱼红细胞氧化应激模型建立方法，将鲤鱼尾部消毒，从每尾鱼尾部抽取约1毫升血液。将血液放入6毫升含肝素钠的鲤鱼生理盐水中，血样在900g，4℃下离心10分钟，弃去上清液。红细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，然后在900g，4℃下离心10分钟。用鲤鱼生理盐水重新悬浮红细胞沉淀，洗涤2次后，细胞沉淀悬浮在6毫升鲤鱼生理盐水中，4℃保存备用。取适量的红细胞悬液，加入等体积的Fe2+/H2O2混合溶液，其终浓度为40μM/20μM，37℃孵育8-10小时。样品在1000g，4℃条件下离心3分钟，细胞样用流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳测定凋亡情况。本发明首次使用Fe2+/H2O2混合溶液为自由基·OH的来源，建立红细胞氧化应激模型。