用于预防糖尿病足截除的微球体药物组合物的制作方法[0001]本申请是申请号为200780009034.5、2007年I月29日、发明名称为“用于预防糖尿病足截除的微球体药物组合物”的专利申请的分案申请。[0003]糖尿病是下肢截除的主要非外伤性危险因素。作为糖尿病主要并发症，足部溃瘍每年的发病率略高于 2 % (Abbott C.A.,等人(2002) The North-West Diabetes FootCare Study !incidence of,and risk factors for,new diabetic foot ulceration in acommunity-based patient cohort.Diabet.Med.第19卷，第5期:第 377 — 384页)。至少有15%的糖尿病患者在其一生中患有足部慢性溃瘍(Reiber G.E.(1996) The epidemiologyof diabetic foot problems.Diabet.Med.第 13 卷增刊 1:第 S6 — 11 页)，并且在这些患者中估计约有 10 % — 30 % 需要下肢截除(Lipsky B.A.(2004)Medical treatment ofdiabetic foot infections.Clin.1nfect.Dis.第 39 卷，增刊 2:第 S104 — 114 页)。进行下肢截除的患者5年 死亡率约为50% — 60% (Reiber G.E.(1996) The epidemiology ofdiabetic foot problems.Diabet.Med.第 13 卷，增刊 1:第 S6 — 11 页)。有很多种方法用于治疗患有慢性局部缺血皮肤溃疡性创伤的糖尿病患者。这些方法包括严格的代谢控制，预防可缓和的危险因素，手术清创术，使用敷料，抗微生物剂治疗感染，减轻受伤处的压力，使用皮肤移植物，生长因子，以及有指征时采用换血管方法。[0004]控制新陈代谢后，手术清创术是治愈糖尿病溃疡的最重要的治疗，应在任意其他局部治疗模式之前进行。手术清创术包括清除所有受损伤区的坏死和感染组织(包括骨)及周围胼胝状组织。[0005]敷料用于糖尿病足部溃疡的用途已被充分建立，尽管已有几种敷料被研究，但每种敷料相对于其他敷料的优点是未知的。另外，由于对敷料应用的研究很少，并且它们主要涉及低等级溃疡，所以还需要更多的临床试验证据证明其功效。已在临床试验中得到研究的新型敷料包括以半透聚合膜，promogram(胶原基质)，藻酸盐,羧甲基纤维素，透明质素为基础的敷料，以及采用亚大气压的(sub-atmospheric)敷料(Eldor R.,等人(2004)New and experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers:acomprehensive review of emerging treatment strategies.Diabet Med.第 21卷，第11期:第 1161 — 1173 页)。[0006]已建立好几种方法，产生置于溃疡处的皮肤替代物。例如，将人真皮的成纤维细胞种在生物可吸收材料的合成支架上，产生皮肤移植物。这种装置显示在低等级溃疡中有效，在较小的时间间隔内就有较高的治愈率(Marston ff.A.,等人(2003)Dermagraft DiabeticFoot Ulcer Study Group.The efficacy and safety of Dermagraft in improving thehealing of chronic diabetic foot ulcers:results of a prospective randomizedtrial.Diabetes Care 第 26 卷:第 1701 — 1705 页)。Apligraf 由两层组成，一层为由在I型牛胶原基质中的人成纤维细胞构成的真皮层，另一层为由人角质形成细胞形成的表皮层。类似地，在将这种皮肤替代物用于神经病性低等级和未感染的溃疡时，其显示产生显著较大和较快的损伤愈合(Veves A.,等人(2001)Graftskin, a human skin equivalent, iseffective in the management of non-1nfected neuropathic diabetic foot ulcers:a prospective randomized multicenter clinical trial.Diabetes Care 第 24 卷:第290 一 295 页)。[0007]在随机，双盲，以安慰剂为参照的III期临床试验中显示，血小板衍生生长因子(PDGF)的凝胶制剂可有效安全地治疗患有神经病性溃疡且具有良好血灌流的糖尿病患者(ffieman T.J.,等人(1998) Clinical efficacy of beclapermin (rhPDGF-BB) gel.DiabeteCare第21卷，第5期:第822 — 827页)。经测面积法评价，本研究中包括的大部分患者(95%)的溃疡面积< 10cm2。与安慰剂相比，贝卡普勒明凝胶100 μ g/g显著增加创伤的完全愈合43% (50vs.35%, P = 0.007)并且减少了达到该效应所需时间32% (86vsl27天，P = 0.013)。使用TOGF ο贝卡普勒明(Regranex)的令人满意的结果使其被批准用于治疗位于糖尿病患者下肢的神经病性溃疡，该溃疡可扩展直到皮下组织或更深并具有合适的血流量(Brem H., Sheehan P., Boulton A.J.(2004) Protocol for treatment of diabeticfoot ulcers.Am.J.Surg.第 187 卷，第 5A 其月:第 1S-10S 页)。[0008]最近，公布了一种愈合剂诸如表皮生长因子(EGF)的给药方法，其包括通过几次注射使EGF溶液浸润至创伤中(W003/053458)。但该方法有一个明显缺点:因为在损伤处进行注射特别疼痛，所以它对患者来说是非常创伤性的。在每次治疗中必须进行几次注射并且患者必须在几周内间隔几天接受治疗。鉴于该方法的缺点，采用EGF的缓释制剂可降低给药频率，这将 大大加强患者的方便及顺从。
[0009]在专利(U.S.6.086.863)中，将调节生长因子(即表皮生长因子)包入含有聚苯乙烯或其他非降解型聚合物的微球体的预防或治疗性组合物中，通过局部应用这些微球体在适当介质中的悬浮液，改善创伤诸如糖尿病足部溃疡的修复过程。由于很多因素可干扰药物吸收，很难控制到达作用位点的剂量，因此药物的局部应用具有与此有关的限制。在所述影响因素中可提及的有:存在坏死组织和局部渗出液，受损的血液流量，降解EGF的酶。
[0010]因此，治疗糖尿病足部溃疡中的重要问题是确定刺激局部缺血组织的再生及预防糖尿病肢截除的药物的有效剂量。
[0011]很多其他专利将注意力集中在为加速治愈速率而设计的其它方法。但是，这些方法中没有一个方法证明是广泛有效的。


[0012]总体上，本发明涉及含有微球体的药物组合物，该微球体载有表皮生长因子,该药物组合物通过在患有慢性局部缺血性皮肤创伤的糖尿病患者下肢经肠胃外途径给药，目的是预防这些肢体的截除。在本发明中，术语“微球体”包括微球体和纳球体。
[0013]将EGF包囊于微球体中:(i)可以缓释药物，以及(ii)保护EGF不被降解处理，诸如位于作用位点的蛋白酶产生的蛋白消化作用。
[0014]在本发明中，可将微球体描述如多聚球体，药物均匀分散在其全部容积中，以受控的方式释放。
[0015]在本发明的背景中，术语“控释”包括持续，不持续，线性或非线性形式的释放药物。这通过使用单独或联合由聚合物基质，包含调节释放性质的赋形剂，和/或加入聚合物降解加强剂或其他调节剂而制成的不同组合物来实现，在组合物的性质方面产生预期效
果O
[0016] 采用Okada等人(US4，652，441)描述的双重乳化/溶剂蒸发法制得微球体。
[0017]开发本发明优选的聚合物是生物兼容的和生物可降解的聚合物。生物可降解性很重要，因为通过其在创伤处的浸润允许肠胃外应用所述制剂。特别优选乙醇酸或乳酸的均聚物和由聚(丙交酯一共一乙交酯)(缩写为PLGA)衍生的共聚物。这些聚合物具有的特性使其可作为优秀的生物材料，用于制备缝合线，整形外科的固定装置以及药物递送系统的聚合物基质(Ashammakhi N.,等人(2001)Developments in CraniomaxillofacialSurgery:Use of Self-Reinforced Bioabsorbable Osteofixation Devices.Plast.Reconstr.Surg.Special Topic:第 167 — 180 页；Eppley B.L.(2005) Use of resorbableplates and screws in pediatric facial fractures.J.0ral Maxillofac.Surg.第 63卷，第3期:第385 — 391页)。关于其性质，除了提供改变以聚合物基质的组合物为基础的药物释放性质，聚合物的分子量及向颗粒中加入其他赋形剂的可能性，它们还具生物兼容性和生物可降解性。
[0018]除了 PLGAs，也可采用其他具有类似性质，诸如生物兼容性和生物降解性的多聚物。它们包括聚己内酯，聚羟基丁酸酯一聚羟基戊酸酯共聚体，聚乳酸一聚己内酯共聚体，聚原酸酯和聚酸酐。
[0019]在一个优选的实施方案中，药物组合物的微球体直径为I — 100 μ m，EGF占微球体总重量的1.6 — 2.4%。
[0020]在另一个优选的实施方案中，微球体包含的EGF在其第一天浸润后，每天释放5 -10 μ g，在14天期间维持其物化和生物性质。
[0021]本发明另一方面是指通过在包括创伤边缘和底部的局部组织中局部浸润给予上述药物组合物,治疗糖尿病患者的局部缺血创伤。
[0022]在微包囊过程后，蛋白药物微包囊需要特别注意这些生物分子的活性。这是因为大部分蛋白对微包囊过程中经常产生的高温和溶解聚合物所用的有机溶剂敏感。另一方面，在微包囊过程中，每种蛋白都表现出自己的行为。考虑到这些方面，建立用于制备载有蛋白并且其活性不变的微球体的方法需要进行额外的研究，以选择适合的方法，聚合物，溶剂，添加剂等。
[0023]作为活性剂，药物组合物中可包含的EGF可以通过化学合成，也可以通过重组DNA技术从天然源中获得。
[0024]药物组合物可包含下列类型的某些附加药物作为赋形剂的一部分:抗微生物剂(青霉素类，头孢菌素类，喹诺酮类，甲硝唑，克林霉素，万古霉素，大环内酯类，四环素类，氨曲南和亚胺培南)，麻醉剂，非留体抗炎药类的止痛剂，具有生血管作用的药物(血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子)，其他生长因子(粒细胞集落刺激因子)或红细胞生成素。[0025]糖尿病患者下肢的慢性局部缺血溃疡性皮肤创伤是采用为本发明的目的药物组合物治疗的病理变化。根据创伤的情况和被治疗患者的特征，药物组合物包含的微球体可能需要共同包囊另一种分子。这些附加治疗剂属于如下组:抗微生物剂，麻醉剂，非留体抗炎药类的止痛剂，具有生血管作用的药物和其他生长因子。
[0026]在给予患者前，药物组合物应悬浮于适当的载体中，该载体可以是盐水溶液，其含有诸如羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素等增粘剂和诸如聚山梨酯或PEG-PLGA-PEG类的热敏水凝胶或壳聚糖或右旋糖酐的衍生物等洗涤剂。
[0027]本发明的目标药物组合物使得能降低治疗过程中的给药频率并通过减少治疗总时间意外地增加了治疗益处，因为创伤的愈合比采用等量非包囊EGF治疗的创伤的愈合更快。因为所获得的缓释特性产生低的EGF浓度，本发明制剂的改善的治疗效果是出人意料的。同样出人意料的是，其他为加快EGF释放并因此获得较大药物浓度而使用某些赋形剂的另一种制剂没有本发明制剂的治疗效果。



[0028]图1为表示动物模型中诱发的溃疡的位置的图解。
[0029]图2表示采用双重乳化一溶剂蒸发法制备载有EGF的微球体的方法图
[0030]图3显不了载有EGF的微球体的电子扫描图
[0031]图4显示了 PLGA微球体释放EGF的性质。X轴显示用天数表示的时间，Y轴表示用本实验用的微球 体中包含的总EGF的百分比表示的释放的EGF的量，(?)快速释放制剂和(籲)缓释制剂。
[0032]图5显示了在不同条件下，被胰蛋白酶消化的EGF的反相高效液相色谱法。A:对照，B:游离EGF，C =PLGA微球体包囊的EGF，D:与空PLGA微球体混合的EGF。

[0033]实施例
[0034]为给本发明提供更完整的描述，描述下列实施例:
[0035]实施例1.制备包含载有EGF的PLGA的微球体的药物组合物
[0036]制备载有EGF的微球体
[0037]将Ig聚合物溶于二氯甲烷(DCM)制成聚合物溶液(PLGA50:50(Sigma，St.Louis,Missouri,USA) 10% (w/v))。将Iml PLGA溶液加入玻璃容器中，再加入200 μ I浓度为20mg/ml的EGF水溶液。用超声探头(IKASONIC U200S控制(IKA Labortechnik，德国)将上述混合物超声30秒。将第一乳液加入40ml的1%聚乙烯醇中，并且采用T8Ultraturrax(IKALabortechnik,德国)通过对相进行HOOOrpm的强烈搅拌得到第二乳液。将双重乳液加入140ml 浓度为 0.1 % 的聚乙烯醇 30000 — 70000 (Sigma, St.Louis, Missouri, USA)，并且用匀衆机(IKA Labortechnik,德国)按300rpm搅拌I小时，以蒸发二氯甲烧。最终，经过滤收集微球体，用50ml蒸懼水洗5遍,并且在冷冻干燥器(Edwards, UK)中冷冻干燥。干燥的微球体保存在4°C直至使用(图2)。
[0038]含有辅料的EGF微球体按相同方法制得，但是在内部水相中添加PluronicF-127 (IOmg)和氯化钠(0.5mg)。[0039]含EGF的微球体的表征
[0040]用IN盐酸中和，通过采用微BCA测试法测定用IN氢氧化钠消化颗粒得到的溶液(测定前先用IN HCl中和)中EGF的浓度以计算微包囊过程的效率和颗粒的蛋白负荷。
[0041]通过微包囊过程制备球形微颗粒。其具有常规表面和孔(图3)。制备这些微球体的收率约为85%。将包囊过程中引入的总蛋白重量的40 — 60%包入微球体是可能的。颗粒表现出的蛋白负荷为1.6-2.4%。该微球体的尺寸小于25 μ m。
[0042]表1.含有EGF的微球体的特征
[0043]