专利名称：α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶,其制备方法和用途的制作方法图1是当用高效液相色谱测定时，经由来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶获得的糖的洗脱模式。图2是环四糖的核磁共振谱(1H-NMR)，所说的环四糖是经采用来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的酶促反应获得的。图3是环四糖的核磁共振谱(13C-NMR)，所说的环四糖是经采用来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的酶促反应获得的。图4代表环四糖的结构，即，环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)。图5显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。图6显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。图7显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。图8显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图9显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图10显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图11显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图12显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图13显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图14显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图15显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图16显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图17显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图18显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图19显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图20显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图21显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图22显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图23显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图24显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图25显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图26显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图27显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图28显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图29显示温度对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图30显示pH对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图31显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图32显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图33显示温度对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图34显示pH对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图35显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图36显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图37显示温度对来源于微生物分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图38显示pH对来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图39显示来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图40显示来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图41利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽三糖的核磁共振谱(1H-NMR)。
图42利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽四糖的核磁共振谱(1H-NMR)。
图43利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽三糖的核磁共振谱(13C-NMR)。
图44利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽四糖的核磁共振谱(13C-NMR)。
图45为本发明的环四糖晶体(五到六水合物)显微镜照片在屏幕上显示的可见中间图。
图46是当用x-光粉末衍射分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖(五到六水合物)的x-光衍射光谱。
图47是当用热重量分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖(五到六水合物)的热重量分析曲线。
图48是当用x-光粉末衍射分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖一水合物的x-光衍射光谱。
图49是当用热重量分析测定时，晶体形式的本发明的一水合物的热重量分析曲线。
图50是当用x-光粉末衍射分析测定时，经在40℃下真空干燥获得的本发明的环四糖(五到六水合物)的无水晶体粉末的x-光衍射光谱。
图51是当用x-光粉末衍射分析测定时，经在120℃下真空干燥获得的本发明的环四糖(五到六水合物)的无水晶体粉末的x-光衍射光谱。
图52是当用热重量分析测定时，本发明的无水环四糖粉末的热重量分析曲线。
实施本发明的最好方式以下是产生本发明的新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的菌株C9，菌株C11，菌株N75以及菌株A19的鉴定结果，鉴定试验按照日本科学学会出版社(日本东京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa编辑的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定方法)中描述的方法进行。菌株C9A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面光滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阳性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性(9)生长条件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用 酸形成D-葡萄糖 + +甘油 + +蔗糖 + +乳糖 + +注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量40％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌C9″，于2000年4月25日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(International Patent Organism DepositaryNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERMBP-7143接受。菌株C11A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；
液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阳性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性(9)生长条件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用酸形成D-葡萄糖++甘油++蔗糖++乳糖++注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量39％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌C11″，于2000年4月25日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7144接受。菌株N75A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阴性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性
(9)生长条件 在5.7-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源利用酸形成D-葡萄糖 ++甘油 ++蔗糖 ++乳糖 ++注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量 40％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌N75″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7591接受。菌株A19A.形态学(1)当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.4-0.8×1.0-4.0μm棒形存在，表现出多态性，不具有运动性，不形成胞子，并且革兰氏染色阳性；(2)当在27℃在EYG琼脂平板上培养时的细胞特征表现出杆菌和球菌的生长循环B.培养性质
(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在一天培养后具有2-3毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状丝状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；不液化琼脂平板。C 生理学性质(1) 淀粉水解 阴性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 阳性(4) 氧化酶 阳性(5) 过氧化氢酶 阳性(6) 氧需求 需氧的(7) 细胞壁的主要二氨基酸 赖氨酸(8) 细胞壁的肽聚糖型 赖氨酸-丙氨酸(9) 细胞壁的N-酰基类型 乙酰基(10)细胞壁的糖组份 半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11)维生素需求 阴性(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量62％(13)DNA-DNA同源性当与球形节杆菌ATCC 8010比较时，具有66.5％的DNA-DNA同源性参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为球形节杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″球形节杆菌A19″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7590接受。
在本发明中，可以适当地使用芽孢杆菌属(Bacillus)，节杆菌属(Arthrobacter)和其它属的任何微生物以及它们的突变体，只要它们形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。通过以本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的物理化学性质为指征，利用用于微生物筛选的常规方法，这些微生物可以容易地筛选到。
来源于节杆菌属微生物(在下文中称为″菌株S1″)(本发明发明人从Okayama-shi，Okayama，日本，土壤中分离到)的α-异麦芽糖基转移酶可以作为α-异麦芽糖基转移酶有利地用于本发明，这种酶从α-异麦芽糖基葡糖基糖通过转移α-异麦芽糖基残基产生环四糖。鉴定试验按照日本科学学会出版社(日本东京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa编辑的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定方法)中描述的方法进行。菌株S1A.形态学(1)当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.3-0.7×0.8-3.5μm棒形存在，表现出多态性，不具有运动性，不形成胞子，并且革兰氏染色阳性；(2)当在27℃在EYG琼脂平板上培养时的细胞特征表现出杆菌和球菌的生长循环B.培养性质
(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在一天培养后具有2-3毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状丝状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；不液化琼脂平板。C 生理学性质(1) 淀粉水解 阴性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 阳性(4) 氧化酶 阳性(5) 过氧化氢酶 阳性(6) 氧需求 需氧的(7) 细胞壁的主要二氨基酸 赖氨酸(8) 细胞壁的肽聚糖型 赖氨酸-丙氨酸(9) 细胞壁的N-酰基类型 乙酰基(10) 细胞壁的糖组份半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11) 维生素需求 阴性(12) DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量65％(13) DNA-DNA同源性当与分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)ATCC 13727比较时，具有84.4％的DNA-DNA同源性参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为分枝节杆菌种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″分枝节杆菌S1″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7592接受。
在本发明中，分枝节杆菌S1的任何突变体都可以适当地用于本发明，只要它形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。通过以可用于本发明的α-异麦芽糖基转移酶的物理化学性质为指征，利用用于微生物筛选的常规方法，这样的突变体可以容易地筛选到。
任何营养培养基都可以用于本发明，只要上述微生物在其中可以生长并产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶；可以任意使用合成的和天然的营养培养基。在本发明中有用的碳源是微生物为其生长而同化的那些这样的例子是来源于植物的淀粉和植物糖原；来源于动物和微生物的糖原和支链淀粉；糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇以及糖蜜；和有机酸，如柠檬酸和琥珀酸。这些碳源在营养培养基中的浓度依据它们的种类适当地改变。在本发明中有用的氮源是，例如，无机氮化合物，如铵盐和硝酸盐；和含有机氮的物质，如尿素，玉米浆，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物以及牛肉膏。在本发明中有用的无机组份是，例如，钙盐，镁盐，钾盐，钠盐，磷酸盐以及锰，锌，铁，铜，钼以及钴的其它盐。如果必要，氨基酸和维生素可以适当地组合使用。
用于本发明的微生物在需氧条件下，通常在4-40℃的温度范围内，更优选地，在20-37℃范围内，在4-10的pH下，更优选地，在5-9的pH下培养。用于本发明的培养时间设定为微生物的生长起始所要求的时间或更长，优选地为10-150小时。在营养培养基中的溶氧浓度(DO)无具体限制，但通常在0.5-20ppm范围内，并且其可以借助于控制通气水平，搅拌，增加氧到空气中以及增加发酵罐内部压力保持在所述范围内。培养自由地以分批或连续方式进行。
在微生物培养完成之后，收集本发明的酶。因为酶的活性在细胞和无细胞培养液两者中发现，后者可被收集作为粗酶溶液而且完整的培养液可以用作粗酶溶液。常规的液-固分离方法可以用于从培养物除去细胞；离心培养液，用涂布滤膜，带有平面滤膜或空心纤维的滤器过滤培养液的方法可以适当地用来从培养液除去细胞。如上所述，无细胞培养液可以用作粗酶溶液，然而，它们可以在使用之前用硫酸铵盐析，丙酮和醇沉淀，真空浓缩，平面膜和中空纤维浓缩来浓缩。
包含本发明的酶的无细胞溶液和它们的浓缩物可以完整使用，或者在用常规方法使酶固定后使用。在这种情况下，例如，利用离子交换剂的缀合方法，利用树脂和膜的共价键合/吸附方法以及利用高分子量物质的包含方法都可以适当地使用。
酶溶液通常包含本发明α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶。如果必要，可以在用常规方法分离/纯化之后使用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。作为例子，根据本发明的电泳同质α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶可以这样获得将培养液中的酶盐析成浓缩物，透析浓缩的粗酶，通过采用树脂“SEPABEADS FP-DA13”的阴离子交换柱色谱，采用“SEPHACRYL HR S-200”的亲和色谱，采用“BUTYL-TOYOPEARL 650M”的疏水色谱以及采用“SEPHACRYL HR S-200”的亲和色谱的顺序色谱纯化透析的溶液。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶具有特征性的物理化学性质，即它可从具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键(glucosidic linkage)的原料糖，经由α-葡糖基转移形成如下糖，该糖具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者，而实质上不增加原料糖还原力；所说的酶不具有形成葡聚糖的能力；并且受EDTA(乙二胺四乙酸)抑制。更具体地说，该酶具有以下显示的物理化学性质；具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖包括，例如，选自下组的一种或多种糖麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，胶化淀粉以及糖原(1)活性经葡基从具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖形成如下糖，后者具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原末端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者，而实质上不增加原料糖还原力；(2)分子量当在SDS-PAGE上测定时，具有约74,000到约160,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电聚焦电泳(isoelectrophoresis)上测定时，具有约3.8到约7.8的等电点。
(4)最适温度当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约40℃到约50℃的最适温度；当存在1mM Ca2+在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃到约55℃的最适温度；当在pH 8.4下温育60分钟时，具有60℃的最适温度；当存在1mM Ca2+在pH 8.4下温育60分钟时，具有65℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育60分钟时，具有约6.0到约8.4的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+在pH 6.0下温育60分钟时，具有约50℃或更低温度的热稳定区；当在pH 8.0下温育60分钟时，具有约55℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+在pH 8.0下温育60分钟时，具有约60℃或更低温度的热稳定区；
(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有在约4.5到约10.0的pH稳定区。
(8)N-末端氨基酸序列酪氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-异亮氨酸，组氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶有用的底物包括具有1，4-糖苷键的多糖，如淀粉，支链淀粉，直链淀粉和糖原；以及可由用淀粉酶，酸，等部分水解上述多糖获得的淀粉部分水解物，如淀粉糊精，麦芽糖糊精以及麦芽寡糖。这些具有α-葡糖苷连接键的葡糖基糖可以进一步用分支酶(EC 2.4.1.18)，例如底物的分支酶处理。用淀粉酶处理的葡糖基糖的淀粉部分水解物的例子是用如在《淀粉酶和相关酶手册》(Pergamon出版社，日本东京(1988)出版)中公开的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，麦芽三糖形成酶(EC 3.2.1.116)，麦芽四糖形成酶(EC 3.2.1.60)，麦芽五糖形成酶，和麦芽六糖形成淀粉酶(EC 3.2.1.98)水解的那些。在制备淀粉部分水解物的情况下，可以任意使用脱支酶，如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和异淀粉酶(EC 3.2.1.68)。
作为底物的淀粉包括来源于农作物的地上淀粉，如玉米，小麦以及稻米淀粉；以及地下淀粉，如土豆，甜土豆以及木薯淀粉。更优选地，这些淀粉使用时被胶化和/或液化成液态形式。部分水解程度越低，环四糖的产率越高，因此，DE设定到约20的水平或更低，优选地，约12或更低以及更优选地，约5或更低。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的转移反应的受体包括了上述底物本身，单糖如葡萄糖，木糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，岩藻糖，山梨糖以及N-乙酰氨基葡萄糖；寡糖如海藻糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，纤维二糖，龙胆二糖，乳糖以及蔗糖；以及其它如麦芽糖醇和L-抗坏血酸。
底物的浓度没有特别限定，本发明的酶促反应甚至在低至0.1％(w/w)(此后在本说明书中，“％(w/w)”缩写为“％”，除非有特别注明)的浓度下进行，然而，百分之一或更高的浓度是用于工业规模产生优选地的。底物溶液可以是以悬浮液形式的那些，其包含不完全溶解的不溶性底物。底物浓度优选地是40％或更低，更优选地是30％或更低。
用于本发明的酶促反应的温度是进行酶促反应的那些，即，不超过约65℃的那些，更优选地是约30℃到约55℃。用于酶促反应的pH通常设定为4.5-10，优选地约5.5到约9。用于酶促反应的时间可以依据酶促反应效率适当被设定。
通过将由上述酶促反应形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖与α-异麦芽糖基转移酶接触，环四糖以令人满意产率产生。可以使α-异麦芽糖基转移酶在上述作用并且灭活本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶后作用在底物上。优选地，这些α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶可以组合使用，以便促进从淀粉或其部分水解物以约30％(d.s.b.)或更高的高产率产生环四糖以及以约80％(d.s.b.)，或更高的产率从糖原产生环四糖。基于两种酶的反应性质，可以按下述估计上述结合使用的的环四糖的形成机制(1)本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用在如下糖的非还原端的α-1，4葡糖基残基上，以释放葡萄糖残基，所说的糖具有至少两个葡萄糖聚合并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键，如淀粉，糖原以及淀粉部分水解物；然后释放的葡萄糖残基分子间转移到其它糖的葡萄糖C-6上的羟基基团上，形成在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的糖；(2)α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的糖，然后分子间把此残基转移到在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的其它糖的葡萄糖残基C-3上的羟基基团上，形成在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖；(3)α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖，以便通过分子间转移作用从糖释放异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基，然后环化所释放的异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基糖成为环四糖；以及(4)通过步骤(1)(3)，环四糖从所产生的没有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖形成，通过依次重复步骤(1)到(3)，环四糖的产率高度提高。
如上所解释的，可以估计，当组合使用时，本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶重复作用在它们的底物上，以增加环四糖的产率。
在环四糖形成反应期间，其它糖转移酶任选可以有利地组合使用，以改进环四糖的产率；当使两种类型的酶，即，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用在，例如，约15％的淀粉部分水解物溶液上时，环四糖以约55％的产率产生，而使用三种类型的酶，即，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶以及环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase)时，在与以上相同的条件下，增加环四糖的最大产率约5-10％，达到约60-65％的改进的产率。
在形成的环麦芽糖糊精的情况下，可以通过使用微生物的培养方法产生，所说的微生物能够产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两者，所说的转移酶特异性地水解由α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖的α-异麦芽糖基部分和其余α-葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移到受体。
作为用于上述使用微生物的方法的培养基，任何合成或天然培养基都可以使用，只要它们含有具有至少为2的葡糖聚合度和在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖，并且其中微生物可以生长。至于其它培养微生物的条件，可以使用用来形成本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的那些。
通过上述酶促反应与培养获得的培养物可以完整地作为包含环四糖或环四糖糖组合物的溶液使用。一般来说，在使用之前，可以采用单独或组合的下列纯化方法对它们进行纯化活性炭脱色，H或OH形式的离子交换树脂脱盐以及柱色谱如离子交换柱色谱，用活性炭的柱色谱以及硅胶柱色谱，用有机溶剂如醇和丙酮的分离，采用适当的可分离性的膜分离，使用酶(如淀粉酶，包括α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)以及α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20))的剩余糖水解，通过酵母发酵或碱处理除去剩余糖的水解。
特别是，离子交换柱色谱优选地用作工业规模的产生方法；强酸性阳离子交换树脂柱色谱，公开于如日本专利公开23,799/83和72,598/83中。用柱色谱，污染糖可以除去，以便有利地产生具有改进含量目标糖的环四糖或包含它的糖组合物。在这种情况下，固定床，移动床以及半移动床方法可以适当使用。
所产生的环四糖与包含它的糖组合物可以适当地浓缩成糖浆产品，并任选地将它们进一步干燥成粉状产品。
为了产生环四糖晶体，例如，在95℃或更低的温度下，优选地在10-90℃温度下，在0.1-20％d.s.b环四糖晶体种子存在时，将具有约30-90％浓度和约至少50％纯度环四糖的高环四糖含量溶液置于结晶罐(任选存在有机溶剂)中，然后在搅拌下逐渐冷却，以获得糖膏(massecuites)。收集环四糖晶体和具有这样的晶体的糖浆的方法包括，例如，常规方法，如分离，块粉碎，流态化粒化和喷雾干燥法。
根据本发明所产生的环四糖是稳定的，高质量的，低甜度，非还原性白色粉末，甚至与下列物质混合或加工时几乎没有褐变，无气味，不变质该物质特别是，例如含氨基酸的物质，如氨基酸，寡肽以及蛋白质。
因为环四糖具有包含能力，它有效地抑制风味组份和有效组份扩散和变质，并且稳定地保持它们。为了这一目的，如果必要，组合使用环四糖和其它环状糖，如环糊精，分支环糊精，环葡聚糖以及环果聚糖，可以有利地改进环四糖包含能力的水平。在本发明中有用的上述环状糖，如环糊精不应该限定成具有高纯度的那些，并且可以有利地是相对低纯度的环四糖，如包含大量麦芽糖糊精与环糊精的淀粉部分水解物。
因为环四糖不被淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解，所以，当口头使用时，它实质上不被身体同化。该糖实质上也不被肠道微生物同化，因此它可以用作非常低热量的水溶性饮食纤维。环四糖实质上也可以用作甜味剂，基本上不造成齿龋，因为它简直不被齿龋诱导微生物同化。该糖抑制粉状产品的粘着和凝固。本发明的环四糖本身是一种具有满意稳定性而无毒性、害处和副作用的天然甜味剂，并且因为这些，其可以有利地用于片剂、糖衣片剂，与赋形剂，例如支链淀粉，羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮组合。此外，环四糖具有控制渗透能力的性质，填充能力，赋予光泽能力，保温能力，粘性，对其它糖的结晶阻止能力，无实质上的可发酵性等等。
这样，本发明的环四糖和包含它的糖组合物在各种组合物，如食品，烟草，香烟，饲料，宠物食品，化妆品以及药物中，可以任意用作甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，稳定剂，脱色预防剂，赋形剂，等等。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以与一种或多种其它甜味剂结合使用，例如，粉化的糖浆，葡萄糖，异构化糖，蔗糖，麦芽糖，海藻糖，蜂蜜，枫树糖，山梨糖醇，麦芽醇，二氢查耳酮，斯替维苷，α-葡基斯替维苷，Momordica grosvenori甜味剂，甘草甜素，祝马丁，L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K，sucralose，甘氨酸以及丙氨酸；以及填料如糊精，淀粉以及乳糖。特别是，环四糖和包含它的糖组合物可以适当地与一种或多种低热甜味剂，如内消旋赤藓糖醇，木糖醇以及麦芽糖醇组合用作低热甜味剂，饮食甜味剂等；或者与一种或多种相对高甜度的甜味剂，如α-葡糖基斯替维苷，祝马丁，L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K以及sucralose结合使用。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意地原封不动地使用，或者在与填料、赋形剂，结合剂等混合后，并形成具有不同形状，如颗粒，球体，平板，立方体以及片状的产品后使用。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物与其它具有酸味，酸性，咸味，美味，涩性以及苦味的有味物质很好地调好；并且具有令人满意的高酸和热耐受性。这样，它们可以极好地用作甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，等等，以增甜和/或改进一般食品的味道和质量，这些食品例如，酱油，粉状酱油，味噌，″funmatsu-味噌″(一种粉状味噌)，″moromi″(一种精炼的清酒)，″hishio″(一种精炼的酱油)，″furikake″(一种熟化的鱼粉)，蛋黄酱，调味品，醋，″sanbai-zu″(一种糖调味汁，酱油和醋)，″funmatsu-sushi-su″(sushi的粉状醋)，″chuka-nomoto″(一种中国鱼的即时混合物)，″tentsuyu″(日本深度脂肪油炸食品的调味汁)，″mentsuyu″(日本细面条调味汁)，调味汁，酱，″yakinik-no-tare″(日本烤肉的调味汁)，咖哩roux，即时炖汤混合物，即时汤混合，″dashi-no-moto″(一种即时储备混合物)，混合调味品，″mirin″(一种甜饼)，″shin-mirin″(一种合成的mirin)，片状糖以及咖啡糖。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物也可以任意地用于下列食品的增甜和/或改进味道和质量″Wagashi″(日本蛋糕)，如″senbei″(稻米饼干)，″arare″(稻米蛋糕块)，″okoshi″(小米和稻米蛋糕)，″gyuhi″(淀粉糊状物)，″mochi″(稻米糊状物)和等，″manju″(具有豆果酱的小面包)，″ufro″(一种甜稻米果子冻)，″an″(大豆酱)等，″yokan″(一种大豆的甜果子冻)，″mizu-yokan″(一种软adzuki豆果子冻)，″kingyoku″(一种yokan)，果冻，pao de Castella以及″amedama″(一日本太妃糖)；西方糕饼，如小面包，饼干，小甜点，馅饼，布丁，黄油奶油，乳蛋糕奶油，奶油蓬松饼，华夫饼干，海绵蛋糕，油炸圈饼，巧克力，咀嚼树胶，焦糖糖果，奶油杏仁糖以及冰糖；冻结甜食，如冰激凌与sherbet；糖浆，如″kajitsu-no-syrup-zuke″(一种保存的水果)和″korimitsu″(削刮冰的糖浆)；糊状物，如面粉糊状物，花生糊状物以及水果糊状物；加工的水果和蔬菜，如果酱，″syrup-zuke″(泡菜水果)以及″toka″(保存的)；泡菜和盐渍产品，如″fukujin-zuke″(红色小萝卜泡菜)，″bettarazuke″(一种整株新鲜小萝卜泡菜)，″senmai-zuke″(一种片块新鲜小萝卜泡菜)以及″rakkyo-zuke″(盐渍冬葱)；泡菜和盐渍产品的预混合，如″takuan-zuke-no-moto″(一种盐渍小萝卜预混合物)以及″hakusai-zuke-no-moto″(一种新鲜白油菜泡菜预混合物)；肉产品，如火腿与香肠；鱼肉产品，如鱼火腿，鱼香肠，″kamaboko″(一种蒸鱼糊状物)，″chikuwa″(一种鱼糊状物)以及″tenpura″(一种日本深度脂肪油炸鱼糊状物)；″chinmi″(调味品)，如″uni-no-shiokara″(海顽童盐肠)，″ika-noshiokara″(枪乌贼的盐肠)，″su-konbu″(加工过的昆布)，″saki-srume″(干燥的枪乌贼带)，″fugu-no-mirin-boshi″(干燥的mirin-seasoned河豚)，熟化鱼粉，如太平洋鳕，海鲤科食用鱼，小虾，等的；″tsukudani″(在酱油中煮沸的食品)，如紫菜类，可食用的野植物，干燥枪乌贼，小鱼以及牡蛎；日常菜，如″nimame″(烹调的大豆)，马铃薯色拉以及″konbu-maki″(昆布卷)；牛奶产品；罐装和瓶装产品，如肉，鱼肉，水果以及蔬菜的那些；醇饮料，如合成的，发酵酒，sake，水果酒，发光醇饮料，啤酒；软饮料，如咖啡，可可，汁液，碳酸盐饮料，酸奶饮料以及包含乳酸菌的饮料；即时食品，如即时布丁混合物，即时热蛋糕混合物，即时汁液或软饮料，即时咖啡，″sokuseki-shiruko″(把adzuki豆汤与稻米蛋糕即时混合)以及即时汤混合物；以及其它食品和饮料，如婴儿固体食品，食疗食品，健康/滋补饮料，肽类食品以及冻结食品。本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意延长或保持新鲜烤制日本和西方糖食的味道与风味，并改进动物和宠物如家养动物，家禽，蜂蜜蜜蜂，蚕以及鱼的饲料和宠物食品的口味；而且，它们也可以任意作为甜味剂，味道改善剂，调味剂，质量改善剂和稳定剂以用在浆状物或糊状物形式的其它产品，如烟草，香烟，牙膏，口红，胭脂，唇油，内服液态药，片剂，锭剂，滴状鳕肝油，软糖，口服清凉剂，漱口剂，化妆品以及药物中。当用作质量改善剂或稳定时，本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意地用于易于丧失其有效组份与活性的生物学活性物质以及包含生物学活性物质的健康食品和药物中。这样的生物学活性物质的例子是包含淋巴因子，如α-，β-或γ-干扰素，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，巨噬细胞迁移抑制因子，集落刺激因子，转移因子以及白细胞介素2的液态制剂；包含激素如胰岛素，生长激素，促乳素，红细胞生成素以及卵泡刺激激素的液态制剂；生物学制剂如BCG疫苗，日本脑炎疫苗，麻疹疫苗，活小儿麻痹症疫苗，天花疫苗，破伤风类毒素，竹叶青属抗毒素以及人类免疫球蛋白；抗生素如青霉素，红霉素，氯霉素，四环素，链霉素以及卡那霉素硫酸盐；包含维生素如硫胺素，核黄素，L-抗坏血酸，鳕肝油，类胡萝卜素，麦角甾醇以及生育酚的液态制剂；高度不饱和脂肪酸和其酯衍生物如EPA，DHA以及花生四烯酸；酶如脂肪酶，弹性蛋白酶，尿激酶，蛋白酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，葡聚糖酶以及乳糖酶的溶液；抽提物如人参抽提物，猛海龟抽提物，小球藻属抽提物，芦荟抽提物以及蜂胶抽提物；以及蜂王浆。通过使用本发明的环四糖和包含它的糖组合物，上述生物学活性物质以及活微生物如病毒，乳酸菌以及酵母的其它浆状物可以任意制备成液体，糊状物，固形物形式的健康食品和药物，其具有令人满意的高稳定性和质量，不担心丧失或失活其有效成份与活性。
如上所述，当与其它组份(一般外用)一起使用时，下列作用和特性也有效地发挥抑制挥发或保持芬芳和风味组份，抑制脱水收缩、其它糖的结晶以及蛋白质、脂质以及活性组份变质，保持湿润以及稳定乳化状态，其由环四糖和包含它的糖组合物发挥；以及稳定性和填料赋予能力的特性，其是环四糖和糖固有的。
类似于其它天然存在的糖，因为本发明的环四糖和包含它的糖组合物在使用到皮肤上时几乎不刺激皮肤，在皮肤中有效地保持湿润，所以它们可以有利地掺入到外用皮肤组合物中使用。在外用皮肤组合物中，本发明的环四糖和包括的糖组合物通常用于与下列一种或多种皮肤学上适用的其它组份适当地组合使用油和脂质，蜡，碳氢化合物，脂肪酸，酯，醇，表面活性剂，染料，香味剂，激素，维生素，植物抽提物，动物抽提物，微生物抽提物，盐，紫外吸收剂，光致敏染料，抗氧剂，防腐剂/杀菌剂，止汗剂/防臭剂，提神剂，螯合剂，皮肤增白剂，抗炎剂，酶，糖，氨基酸以及增稠剂。例如，在化妆品领域中，外用皮肤组合物可以洗液膏，乳状洗液，凝胶，粉末，浆状物或者块状物的形式提供，例如，清洁化妆品，如肥皂，化妆皂，皮肤洗涤粉，洗面霜，洗面剂，身体香波，身体洗液，香波以及洗发粉；头发化妆品，如成套洗剂，头发喷剂，润发油，发乳，发蜡，发胶，发液，头发滋补剂，头发洗剂，生发剂，头发染料，头皮处理剂，头发化妆品，增光发油，发油以及梳头油；基础化妆品，如化妆洗剂，雪花膏，润肤霜，润肤洗剂，胶冻，胶冻擦剂，糊状洗剂，粉末，清洁霜，冷霜，手霜，手洗剂，乳状洗剂，保湿液，剃须前/后洗剂，剃须后霜，剃须后泡沫，剃须前霜以及婴儿油形式的化妆盒；补充化妆品，如以液体，霜或固体形式的粉底，滑石粉，婴儿粉，体粉末，香料粉，化妆基料，以霜，糊状物，液体，固体或粉末形式的粉料，眼影，眼霜，睫毛油，眉笔，睫毛化妆品，口红，口红洗剂；芳香化妆品，如芳香剂，膏状/粉状芳香剂，科隆香水(eau deColognes)，香水Colognes以及香水(eau de toilette)；日晒和防晒化妆品如防晒霜，防晒洗剂以及防晒油；指甲化妆品，如修指甲材料，修脚材料，指甲颜料，指甲漆以及指甲化妆品材料；眼线膏化妆品；口红和唇膏，如唇膏，唇油，糊状胭脂以及唇上光剂；口腔化妆品，如牙膏和口洗涤剂；以及沐浴化妆品，如浴盐/油以及沐浴化妆材料。在药物领域中，外用皮肤组合物可以以湿敷布，喷射剂，敷贴剂，浴剂，粘着剂，软膏，糊状物，涂擦剂，洗剂以及泥敷剂的形式提供。
可以和环四糖和包含它的糖组合物一同掺入外用皮肤组合物的其它组份的具体例子是油和脂肪，包括在室温下为液体形式的植物油，如鳄梨油，杏仁油，橄榄油，芝麻油，红花油，大豆油，山茶油，桃仁油，蓖麻油以及棉子油；在室温下为固体形式的植物脂肪，如可可脂肪，棕榈脂/油以及植物蜡；以及动物油，如貂油，蛋黄油以及海龟油。
在本发明中有用的蜡的例子是，植物蜡如hohoba油，巴西棕榈蜡以及小烛树蜡；动物蜡如鲸蜡油，Baird’s槌鲸油，蜂蜡，鲸油以及羊毛脂；以及矿物油如褐煤蜡。
在本发明中有用的碳水化合物是，例如，矿物碳水化合物，如石蜡或固体石蜡，液态石蜡，地蜡，微晶蜡以及矿脂；以及动物碳氢化合物，如角鲨烷和角鲨烯。
在本发明中有用的脂肪酸的例子是月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，油酸，山嵛酸，十一碳烯酸，羊毛脂脂肪酸，硬羊毛脂脂肪酸，软羊毛脂脂肪酸，异硬脂酸以及其衍生物。
在本发明中有用的醇类是，例如，高级醇，包括多元醇，如月桂醇，鲸蜡醇，seto十八烷醇，十八烷醇，油醇，二十二烷醇，羊毛脂醇，氢化羊毛脂醇，己基癸醇，辛基十二烷醇以及聚乙二醇；低级醇，包括多元醇，如乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，乙二醇，丙二醇以及甘油；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的酯的例子是，月桂酸己基酯，豆蔻酸异丙基酯，豆蔻酸十四烷基酯，豆蔻酸鲸蜡基酯，豆蔻酸辛基十二烷基酯，棕榈酸异丙基酯，硬脂酸丁基酯，胆甾醇硬脂酸酯，胆甾醇乙酸酯，胆甾醇n-乳酸酯，胆甾醇己酸酯，胆甾醇月桂酸酯，胆甾醇肉豆蔻酸酯，胆甾醇棕榈酸酯，胆甾醇硬脂酸酯，胆甾醇12-羟基硬脂酸酯，油酸癸酯，油酸辛基十二烷基酯，羊毛脂脂肪酸异丙基酯，甘油三豆蔻酸酯，丙二醇二油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鲸蜡基酯，羊毛脂乙酸酯，二甲基辛酸己基癸基酯以及它们的衍生物。
在本发明中有用的表面活性剂是，例如，阴离子表面活性剂，如月桂酸锌，豆蔻酸锌，棕榈酸锌，硬脂酸镁，十二烷基硫酸钠，聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠，三乙醇胺聚氧乙烯月桂基醚硫酸盐，聚氧乙烯鲸蜡基醚磷酸盐，聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸盐，N-十二烷基肌氨酸钠，椰子脂肪酸肌氨酸三乙醇胺，椰子脂肪酸钠甲基牛磺酸以及大豆磷脂；阳离子表面活性剂如氯化硬脂酰三甲基铵，氯化二硬脂酰二甲基铵，氯化苯甲烃铵，氯化鲸蜡基吡啶鎓，溴化烷基异喹啉鎓以及溴化十二烷基二甲基2-苯氧乙基铵；兼性离子表面活性剂如β-月桂基氨基丙酸钠，甜菜碱月桂基二甲基氨基乙酸酯以及2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉鎓甜菜碱；非离子型表面活性剂如甘油一硬脂酸酯，自乳化的，甘油一硬脂酸酯，亲脂的脱水山梨糖醇一月桂酸酯，脱水山梨糖醇一油酸酯，蔗糖脂肪酸酯，十一碳烯酸一乙醇胺，椰子油二乙醇胺，聚乙二醇一油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鲸蜡基酯，聚氧乙烯鲸蜡基醚，聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇一硬脂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯，聚氧乙烯蓖麻油以及聚氧乙烯氢化蓖麻油；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的染料例子是，红焦油染料如，赤藓红，苋菜红，玫瑰红，酸性红，色淀红C，立索红，若丹明，亮色淀红，曙红YS，紫胺R，亮坚牢深红，丽春红R，橙色焦油染料如二溴荧光素，永久橙，赤藓红黄NA以及橙色I；黄色焦油染料如酒石黄，晚霞黄，荧光素钠，联苯胺黄G，萘酚黄S以及黄AB；绿色焦油染料如固绿FCF，茜素菁蓝绿F，浅绿SF黄以及萘酚绿B；蓝色焦油染料如亮蓝FCF，靛蓝胭脂红，靛蓝，专利蓝NA，carbanthrene蓝以及苏丹蓝；棕色焦油染料如间苯二酚棕；紫色焦油染料如茜素紫；黑色焦油染料如萘酚蓝黑；无机颜料，如氧化锌，氧化钛，氢氧化钴，氢氧化铝，滑石，陶土，云母，皂土，紫罗兰锰以及云母钛；类胡萝卜素颜料，如β-类胡萝卜素，番茄红素以及藏红花素；黄酮类颜料，如sisonine，藏红花黄，芸香苷以及栎精；黄素颜料，如核黄素；醌颜料，如胭脂虫红，茜素以及shikonin；以及它们的衍生物。
一般在外用皮肤用品中使用的香料粗略地可以分成天然植物以及动物香料，合成香料以及它们适当组合的混合物。动物香料的例子包括麝香，灵猫酮以及龙涎香。植物香料，例如，蒸溜物，即，可由蒸馏获得精油，例如，用水蒸发茴香种子，罗勒叶，藏茴香果，肉桂皮，胡荽种子，熏衣草花，肉豆蔻种子，薄荷叶，玫瑰花，迷迭香花、种子及叶，以及麝香草叶；一般依据性质和方法分类成纯净物，树脂状物质，含油树脂和酊剂的抽提物。合成香料的例子是苯乙酮，茴香醚，苄基醇，乙酸丁基酯，樟脑，柠檬醛，香茅醇，枯茗醛，蒿脑，乙基香兰酮，醋酸香叶酯，linarol，薄荷醇，甲基对-甲酚，水杨酸甲基酯，乙酸苯基酯，香兰素以及它们的衍生物。在本发明中，可以任意使用与以上所述香料适当组合的组合物。
在本发明中有用的激素包括，例如，卵泡激素如雌酮和雌二醇；促孕素，如孕甾酮和孕烯醇酮；以及肾上腺皮质激素如可的松，氢化可的松以及泼尼松龙。在本发明中有用的维生素是，例如，维生素A类化合物如视黄醇，视黄酸，α-，β-和γ-胡萝卜素以及它们的衍生物；维生素B类化合物如硫胺素(维生素B1)，核黄素(维生素B2)，维生素B6，包括吡哆醇，吡哆醛以及吡哆胺以及它们的衍生物；维生素C类化合物如L-抗坏血酸，2-O-α-D-葡糖基-L-抗坏血酸，L-抗坏血酸和葡糖基-L-抗坏血酸的酰基衍生物，别名亲脂性维生素C，以及L-抗坏血酸的其它酸衍生物如L-抗坏血酸的硫酸酯；维生素D类化合物如麦角骨化醇，胆钙化醇以及它们的衍生物；以及维生素E类化合物如α-，β-和γ-和δ-生育酚，α-，β-和γ-和δ-tocotrienol以及它们的衍生物。
除了以上提到的用作香料的植物抽提物之外，在本发明中有用的植物抽提物的例子是，抽提物如春黄菊，鼠尾草，芦荟，深红鼠尾草，Angelica keiskei，鳄梨树，荨麻，茴香，乌龙茶，coak树皮，大麦，咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)，甜胡椒，海草，木瓜，甘草，温桲子，栀子，Sasa albo-marginata，肉桂，红茶，米糠，发酵米糠，Stevia rebaudiana，芹菜，日本绿色龙胆，大豆，麝香草，茶，普通山茶，日本当归，玉米，胡萝卜，Rosa rugosa，hinoki(日本柏树)，丝瓜，红花，松树，桃子，桉树，爬行虎耳草，yuzu(圆佛手柑)，百合花，薏苡，艾类植物，Cyanophta(蓝绿藻类)，海草，苹果，粘质沙雷氏菌以及莴苣的那些；以及从植物分离的化合物如扁柏酚，甘菊环，叶绿素以及甘草甜素。在本发明中有用的动物抽提物包括胎盘抽提物。
微生物的抽提物的例子是酵母提取物。在本发明的外用皮肤组合物有用的盐有利地包括可以一般用于常规外用皮肤组合物的那些以及海水，深海水，海水干燥组份以及天然盐，包括液体形式的那些，如矿物盐。
在本发明中有用的紫外吸收剂包括，例如，对-氨基苯甲酸，对-二甲基氨基苯甲酸乙己基酯，对-甲氧基肉桂酸乙己基酯，2-(羟基-5-甲苯基)苯并三唑，oxibenzozone，尿刊酸，尿刊酸乙酯以及它们的衍生物；能够遮蔽紫外线的有机物质如5-氯尿嘧啶以及鸟嘌呤胞嘧啶。在本发明中有用的光敏染料的例子是2，2’[3’-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亚噻唑啉-2-基)亚乙基]亚丙烯基]双[碘化3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓]别名″PLATONIN″，碘化2-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亚噻唑啉-2-基)次甲基]-3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓别名″PIONIN″，6-[2-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]乙烯基]-1-乙基-2-甲基吡啶鎓别名″TAKANAL″，碘化2-(2-苯胺乙烯基)-3，4-二甲基-噁唑啉鎓″LUMINEX″以及其衍生物。
除上述具有抗氧化能力的化合物之外，在本发明中有用的抗氧剂包括，例如，没食子酸丙酯，没食子酸丁酯，没食子酸辛酯，没食子酸十二酯，去甲二氢愈创木酸(NDGA)，叔丁基羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，4-羟基甲基-1-2，6-二叔丁基苯酚以及它们的衍生物。
除上述的具有灭菌或杀菌活性的化合物之外，在本发明中有用的防腐剂和杀菌剂的例子包括，酚类化合物如苯酚，对氯间甲酚，树脂酚，对氧代苯甲酸以及甲酚；酸化合物包括以盐形式的那些，如苯甲酸，山梨酸，水杨酸以及硼酸；卤化双酚，如六氯苯，硫双二氯酚以及二氯苯；酰胺如3，4，4’-三氯carvaniride，十一碳烯酸一乙醇胺；季铵化合物如氯化苯甲烃铵，氯化苄甲乙氧铵以及氯化decalinium；氯己定盐酸盐，1-羟基吡啶-2-硫酮，溶菌酶氯化物；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的止汗剂/除臭药是，例如，氯化铝，氯化锌，氯羟基铝，铝氯羟基尿囊素盐，铝二羟基尿囊素盐以及铝氯水合物。在本发明中有用的提神物的例子包括薄荷醇，薄荷/欧薄荷油，樟脑，百里酚，螺烷醇以及甲基水杨酸。在本发明中有用的螯合剂，例如，乙二胺四乙酸的衍生物，三聚磷酸，六异丁烯酸，二氢乙基甘氨酸，柠檬酸，酒石酸，葡糖酸以及糖酸。
除上述具有皮肤增白活性的化合物之外，在本发明中有用的皮肤增白剂是，例如，核酸如反义寡核苷酸，包括酪氨酸酶基因的反义寡核苷酸；曲酸，乳酸，邻氨基苯甲酸，香豆素，苯并三唑，咪唑啉，嘧啶，二噁唑，呋喃，吡喃酮，烟酸，熊果苷，贝加灵，贝加因，小檗碱以及它们的衍生物；黑色素形成抑制剂，酪氨酸酶形成抑制剂以及酪氨酸酶抑制剂。
除上述具有抗炎活性的那些之外，在本发明中有用的抗炎剂的例子包括，例如，尿囊素，尿囊素乙酰基-DL-甲硫氨酸，β-甘草次酸尿囊素盐，鱼石脂，吲哚美辛，乙酰水杨酸，苯海拉明氯化物，愈创蓝油烃，camazulene，氯苯那敏顺丁烯二酸盐，甘草甜素，甘草次酸以及orentalgromurel抽提物。在本发明中有用的酶的例子是来自芽孢杆菌属和链霉菌属微生物和酵母的那些；以及来源于植物和动物的那些，如蛋白酶，脂肪酶以及溶菌酶。
在本发明中有用的糖是例如，寡糖如蔗糖，麦芽糖，果糖，乳糖以及海藻糖；环四糖以外的环状糖，如环糊精；糖醇如麦芽糖醇，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇以及阿拉伯糖醇；多糖如透明质酸，硫酸软骨素，支链淀粉，纤维素，淀粉，葡聚糖，果胶，角叉菜胶，瓜尔胶，玉米浆，阿拉伯树胶，黄蓍胶，黄原胶以及壳多糖，它们的衍生物和部分水解物。在