专利名称：一种利用阿魏菇液体发酵产漆酶的方法漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC I. 10. 3.2),是一种含铜的多酌· 氧化酶，广泛分布于植物、细菌和真菌中，此外，在一些昆虫中也发现了漆酶的存在。漆酶是单电子氧化还原酶，其催化底物包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物以及一些金属离子等。由于作用底物广泛，漆酶对于在食品工业、制浆造纸、人工合成染料脱色、 新型环保材料研制等领域具有巨大的价值。在食品工业中，漆酶被广泛应用于控制饮料的澄清与色泽。传统方法是将饮料经凝胶、斑脱土和二氧化硅等物质进行吸附处理，从而增加其稳定性。与传统方法相比，利用漆酶稳定果汁具有诸多优点，如澄清效果稳定、不需采用澄清剂或助滤剂、且利于自动化处理。有研究结果表明，利用漆酶处理果汁可以获得稳定和澄清的果汁，且不需要过多的投资。在造纸技术中，制浆过程主要需要木质原料中的纤维类物质，而在木质原料中，纤维物质与木质素紧密胶连在一起，因此需要采用化学或物理的方法，降解或者去除木质素才能达到分离的目的。漆酶具有良好的降解木质素的能力，且无化学法和物理法中能耗高、 污染大等缺点，因此在造纸制浆中有广阔的应用前景，而且漆酶优良的降解木质素的能力， 很好的解决了木质素的存在对纸张的强度和颜色的影响。在纺织工业中，每年有10% - 20%的染料随着废水被排放到环境中。这些染料大多数为具有抗光照、抗氧化的难降解芳烃类化合物，这类物质不但对环境造成了危害，还由于其自身具有有毒、致癌物质，对人体健康也造成了威胁。由于漆酶对单酚、邻苯二酚和对苯二酚等底物较好的氧化降解作用，使其被广泛应用于染料的脱色降解。漆酶不仅可以应用于纺织工业废水的处理，还可以直接参与到牛仔布染色的生产环节中，具有降低牛仔布的强度损失、减少处理时间、漆酶可重复利用、减少耗水量和避免刺激性化学物质漂白等诸多优点。阿魏燕(Pleurotus ferulae Lenzi),学名阿魏侧耳,在我国是新疆特有的燕类， 主要分布于新疆的伊犁、塔城、阿勒泰和木垒等地区，是寄生在药用植物“阿魏”腐败根茎上的一种重要的食药用真菌。目前，已经发现有多种具有产漆酶能力的侧耳类真菌，如糙皮侧耳(平菇)、刺芹侧耳(杏鲍菇)、环柄侧耳(凤尾菇)等，但未曾有关于阿魏侧耳(阿魏菇)发酵产漆酶的相关研究和报道。
本发明的目的在于提供一种利用阿魏菇生产漆酶的方法。本发明的技术方案具体的，通过以下步骤实现。(I)斜面培养，把经组织分离得到的阿魏菇菌种接种到斜面培养基上，在25°C条件下培养，至菌丝体长满斜面；(2)种子培养，将斜面菌种接种到种子培养基中，在25°C，摇床转速150转/分钟的条件下培养7 天；(3)发酵培养，将培养好的种子接种到发酵培养基中，接种量4% (体积百分比)，在22 -26°C，摇床转速150转/分钟的条件下培养7天。本发明使用的阿魏菇菌种是通过采自新疆的野生阿魏菇经组织分离得到。组织分离的方法在多种教科书和论文中均有表述，这里不再详细列出(例如上海市农业科学院编， 《食用菌栽培手册》第12 - 13页，1981年，食用菌杂志社编辑部出版社)。本发明所述的斜面培养基为土豆培养基(PDA培养基)，组成(单位克/升)土豆 200，葡萄糖20，琼脂20，用自来水配制，pH自然，121。。灭菌20分钟。本发明所述的种子培养基组成(单位克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10， KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 2，用自来水配制，pH自然，121。。灭菌20分钟。本发明所应用的发酵培养基组成(单位克/升)葡萄糖15 - 20，玉米粉10 -20，麸皮 10 - 15，KH2PO4 3，MgS04*7H20 2，用自来水配制，起始 pH 为 7. O - 9.0，121。。灭菌20分钟。漆酶酶活力的测定方法详见实施例。本发明的有益效果本发明成功的实现了利用阿魏菇生产漆酶的工艺，其发酵水平达到或超过其他侧耳类真菌的发酵水平。这为微生物发酵产漆酶提供了一种新的方法， 同时也为阿魏菇在发酵工业上的应用开发出一种新方向。取采自新疆阿勒泰地区的野生阿魏菇新鲜未开伞的子实体，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75%乙醇进行子实体表面消毒后，移入超净工作台紫外灯照射20分钟。用灭过菌冷却后的解剖刀将子实体一分为二，在菌柄内或菌柄中、菌柄与菌盖交界处、菌盖和菌褶处切割表皮内组织，将组织切成黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表皮组织。用无菌镊子接入试管斜面培养基(即PDA培养基)，每个组织部分各接种10支试管斜面，25°C培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至7天时，用PDA培养基试管斜面转接。实施例2、阿魏菇液体发酵产漆酶(1)斜面培养将实施例I得到的阿魏菇菌种接种到斜面培养基(即PDA培养基)上，在 25°C环境下培养大约7天时间，至菌丝体长满斜面；(2)种子培养将斜面菌种接种到装有60毫升种子培养基的250毫升的三角瓶中，种子培养基组成(单位克/升):葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10,KH2PO4 3，MgSO4 ·7Η20 2, pH 自然，121°C灭菌20分钟；在摇床转速150转/分钟，25°C条件下培养7天；(3)液体发酵培养取培养好的种子6晕升接种到装有150晕升发酵培养基的500晕升的三角瓶中。发酵培养基组成(单位克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麸皮10，KH2PO4 3， MgSO4 · 7H20 2，起始pH为7. 0，121。。灭菌20分钟；在摇床转速150转/分钟，22°C条件下培养7天，最终得到含有漆酶的阿魏菇发酵液，测得发酵液中漆酶酶活力7156. 3 U/L。
漆酶酶活的具体测定按以下方法进行
取发酵液I毫升，在8000转/分钟的条件下离心10分钟；取上清液，测定漆酶酶活。 测定漆酶酶活力时以2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物， 每分钟氧化I微摩尔ABTS底物所需要的酶量定义为I个酶活单位(U)。在I毫升反应体系中，底物ABTS终浓度为I毫摩尔/升，其中含有100毫摩尔/升pH值为4. 5的乙酸钠缓冲液880微升，100微升ABTS和20微升发酵上清液，整个反应体系在30°C下反应5分钟，在 420 nm下测定其吸光度的变化。酶活力按以下公式计算


一种通过阿魏菇液体发酵生产漆酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明方法以阿魏菇为生产菌株，经液体发酵产漆酶，主要通过以下步骤实现(1)斜面培养，(2)种子培养，(3)液体发酵培养，将培养好的种子按4%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵培养基中组成(单位克/升)葡萄糖15-20，玉米粉10-20，麸皮10-15，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，起始pH为7.0-9.0，在摇床转速150转/分钟，22-26℃条件下培养7天。本发明成功的实现了利用阿魏菇生产漆酶这一目标，其发酵水平达到或超过其他侧耳类真菌的发酵水平。这为微生物发酵产漆酶提供了一种新的方法，同时也为阿魏菇在发酵工业上的应用开发出一种新方向。