专利名称：茶多酚壳聚糖纳米粒制备方法及应用的制作方法壳聚糖(Chitosan，CS)为天然多糖甲壳素，CS又称壳糖胺、几丁聚糖等，是甲壳素脱乙酰化得到的β-(1,4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖单元和β-(1,4)-2-氨基-D-葡萄糖单元的共聚物，后者含量一般超过80%。CS是自然界唯一的一种阳离子多糖，可生物降解，无毒，具有良好的生物相容性、高电荷密度和粘膜高粘附性。近年来，CS及其衍生物在生物医学、药学、生物工程等领域的研究日益活跃，例如其所制成的可吸收缝线和人工皮肤均已进入临床应用并有上市商品。壳聚糖纳米粒除了具备壳聚糖的特性外，还具有纳米粒材料的普遍特征，例如小尺寸效应、大比表面积等。壳聚糖纳米粒的制备方法主要有以下几种①离子凝胶法，即利用三聚磷酸钠(TPP)对壳聚糖进行离子诱导凝胶化形成壳聚糖纳米粒(1-2)。此方法在室温下即可发生反应，工艺简单，并且不用使用有机溶剂，条件可控性高，易于大规模工业化生产。②共价交联法，即采用水/油乳化剂进行乳化，以戊二醛为交联剂对壳聚糖游离氨基进行交联，该方法所得粒子形态稳定，粒径均匀，但使用了大量有机溶剂和表面活性剂，并且戊二醛有一定的细胞毒性以及对大分子药物的灭活作用。③大分子复合法，即将电荷相反的阴离子大分子物质与含氨基的壳聚糖在溶液中进行复合，利用两者之间的静电相互作用在一定条件下形成壳聚糖纳米粒，该法工艺简单，条件温和，在包载基因方面具有粒径小、稳定性好等优点，用该法制备包载DNA的壳聚糖纳米粒一直是国内外研究的热点(3)。④自组装法，即利用经化学改性后的壳聚糖，该壳聚糖具有两亲性，可以在水溶液中自组装形成壳聚糖纳米粒(4)。在上述各种制备壳聚糖纳米粒的方法中，离子凝胶法是目前使用最多的方法。介孔SiO2 纳米粒子(mesoporous silica nanoparticles, MSN)具有在 2 5Onm范围内可连续调节的均一介孔孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面和无生理毒性等特点，非常适合用作药物分子的载体(5)。同时，MSN具有巨大的比表面积(>900m2/g)和比孔容(>0. 9cm3/g)，可以在孔道内负载各种药物，并可对药物起到缓释作用，提高药效的持久性出)。因此，近年来MSN在可控药物传输系统方面的应用日益得到重视。目前，MSN的长期生物相容性与生物降解性还没有得到深入的研究，但许多研究结果显示，MSN具有良好的生物相容性，可以用作药物载体。载药过程通常是将载体浸泡在高浓度的药物溶液中，然后分离、干燥。MSN的孔径大小决定了能够进入孔道内的药物分子的大小，因此，MSN的药物吸附主要由粒子的孔径大小决定。一般情况下，只要MSN的孔径稍大于药 物分子的尺寸就可以将药物吸附到孔内。MSN吸附药物的能力主要来源于介孔表面与药物之间的氢键作用、离子键相互作用、静电相互作用和疏水性相互作用等。MSN的比表面积和比孔容对载药量的影响很大，在孔径允许的情况下，比表面积越大吸附药物的量也就越大(7)。目前，关于MSN类药物传输系统主要集中在控制MSN的形态、稳定性和分散性上，以及设计新颖的靶向 、控释药物输送体系。茶的历史悠久并且被广泛接受，不仅是因为茶具有解渴的功效，更重要的是茶叶具有多种医疗保健功能。茶叶的有效成分大致可以分为酚类、多糖类、维生素类、氨基酸类等，其中以茶多酚、茶多糖、氨基酸在茶叶中的含量较多，所起的作用相对较大，一般被认为是茶叶中的主要活性成分，截至目前对它们的研究也最广泛和深入。这些活性成分有很多功能例如是一种很有效的天然的抗氧化剂，可以降血脂，可以消炎抗辐射，预防和治疗肿瘤的功能等等。但是这些成分在潮湿、阳光、高温等条件下极易发生氧化、聚合、缩合等反应，稳定性很差，口服生物利用度特别低，另外自身又存在苦涩的味道等问题，因此限制了茶多酚的应用(8-11)。文献也有报道利用壳聚糖纳米粒来包裹茶多酚(12-13)，但是研究结果表明，茶多酚在纳米粒中的含量比较低，另外，茶多酚的稳定性没有得到根本性的提高，茶多酚的生物利用度没有得到大幅度的提高。本发明利用壳聚糖纳米粒做为载体，以茶多酚作为茶叶有效成分之一对其进行了纳米化研究，在纳米粒中加入多孔二氧化硅显著增强茶多酚的含量，并且显著缩短茶多酚在水溶液中的时间，采用冷冻干燥的方法来干燥纳米粒，显著增强了茶多酚的稳定性。此方法制备得到茶多酚纳米粒，为解决茶多酚应用的局限性提供参考。
本发明目的在于提供了一种茶多酚壳聚糖纳米粒，其特征在于主要由以下重量份的组分制成壳聚糖I 7份、多孔二氧化硅I 5份、茶多酚I 7份。其中各组分的重量份配比优选为壳聚糖2 6份、多孔二氧化硅I 3份、茶多酹I 5份。各组分的重量份配比进一步优选为壳聚糖3 6份、多孔二氧化硅I 2份、茶多酹I 4份。其中所述壳聚糖的分子量为10,000 600,000 ;所述多孔二氧化硅的粒径在10-50n m，并且具有多孔性。本发明目的还在于提供了一种茶多酚壳聚糖纳米粒的制备方法、茶多酚的含量测定方法以及茶多酚载药量和包封率的测定方法。 茶多酚壳聚糖纳米粒制备方法如下采用三聚磷酸钠(TPP)离子凝胶法制备茶多酚壳聚糖纳米粒，即先将多孔二氧化硅分散在茶多酚的水溶液中，然后在该溶液中加入壳聚糖水溶液(I. 5 6. Omg/ml)，最后将TPP水溶液(O. 4 3. Omg/ml)滴加到壳聚糖溶液中，磁力搅拌约lh，得到茶多酚纳米粒胶体溶液。取该纳米粒胶体溶液加入乳糖做冻干保护剂，冷冻干燥48h，即得茶多酚纳米粒固体粉末。茶多酚的含量测定方法茶多酚的含量测定采用紫外分光光度法测定，即茶多酚溶液在波长280nm处有最大吸收，其线性范围是5-40 μ g/ml。纳米粒中茶多酚的包封率测定纳米粒胶体溶液经超速离心(40，000 Xg) Ih后，取上清液，紫外分光光度法测定游离茶多酚的含量。包封率％=(茶多酚的总质量-游离茶多酚的质量)*100% /茶多酚的总质量纳米粒中茶多酚的含量测定精密称取茶多酚纳米粒约10_50mg，置于小烧杯中，加入甲醇，避光，电磁搅拌约l-2h，取上清液体。提取2次，合并2次提取液，置于容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密量取以上溶液在波长280nm处测定吸收度，从而得到茶多酚的浓度。载药量％=(茶多酚浓度*体积/纳米粒的质量)*100%本发明目的还在于提供了一种茶多酚纳米粒在降血脂、降血压、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤药物中的用途。 包封率载药量 纳米粒I > 90% > 30% 纳米粒230% 4%加入多孔二氧化硅后可以显著提高茶多酚的包封率和载药量。[实施例2]茶多酚壳聚糖纳米粒的稳定性考察将茶多酚原料、纳米粒I、纳米粒2在室温放置2个月后发现，茶多酚原料放置几天后吸潮，颜色变成红色，经紫外波长扫描显示，茶多酚被氧化成醌类物质，形成二聚体，最大吸收峰红移。而纳米粒I和2中，茶多酚被包裹在微球中，颜色没有显著变化，紫外最大吸收波长没有发生改变。参考文献
I.Nasti A， et al. (2009)Chitosan/TPP and chitosan/TPP-hyaluronicacid nanoparticles !systematic optimisation of the preparative process andpreliminary biological evaluation. (Translated from eng)Pharm Res 26(8)1918-1930(in eng).2. Wu Y,Yang W,Wang C，Hu J，& Fu S (2005)Chitosan nanoparticles as a noveldelivery system for ammonium glycyrrhizinate. (Translated from eng)Int J Pharm295(1-2) :235-245 (in eng).3. Hu Y，et a I. (2002) Synthe sis and characterization ofchitosan-poly (acrylic acid)nanoparticles. (Translated from eng)Biomaterials23(15) :3193-3201 (in eng). 4. Chae SY,Son S，Lee M，Jang MK,& Nah JW(2005)Deoxycholic acid-conjugatedchitosan oligosaccharide nanoparticles for efficient gene carrier. (Translatedfrom eng)J Control Release 109(1-3) :330-344(in eng).5. Vallet-Regi M，Balas F，& Arcos D (2007)Mesoporous materials for drugdelivery. (Translated from eng)Angew Chem Int Ed Engl 46(40) :7548-7558(in eng).6. Slowing, II，Vivero-Escoto JL, Wu CW, & Lin VS(2008)Mesoporous silicananoparticles as controlled release drug delivery and gene transfectioncarriers. (Translated from eng)Adv Drug Deliv Rev 60(11) : 1278-1288 (in eng).7. Huh S，et al. (2003)Tuning of particle morphology and pore propertiesin mesoporous silicas with multiple organic functional groups. (Translated fromeng)Chem Commun(Camb)(18) :2364-2365(in eng).8.Choi JS & Burm JP (2009)Effects of oral epigallocatechin gallate onthe pharmacokinetics of nicardipine in rats. (Translated from eng)Arch Pharm Res32(12) 1721-1725(in eng).9. Chung JH，Choi DH, & Choi JS (2009) Effects of oral epi gal locatechingallate on the oral pharmacokinetics of verapamil in rats. (Translated from eng)Biopharm Drug Dispos 30(2) :90-93 (in eng).10. Jeon HY,Kim JK,Kim WG,& Lee SJ (2009)Effects of oral epigallocatechingallate supplementation on the minimal erythema dose and UV-induced skindamage. (Translated from eng)Skin Pharmacol Physiol 22(3) :137-141 (in eng).11. Jhoo JW, et al. (2005) Stability of black tea polyphenol, theaflavin,and identification of theanaphthoquinone as its major radical reaction product.(Translated from eng)J Agric Food Chem 53(15) :6146-6150 (in eng).12. Garlea A,Melnig V，& Popa MI(2010)Nanostructured chitosan-surfactantmatrices as polyphenols nanocapsules template with zero order release kinetics.(Translated from eng)J Mater Sci Mater Med 21 (4) :1211-1223 (in eng).13.Dube A, Nicolazzo JA, & Larson I(2010)Chitosan nanoparticlesenhance the intestinal absorption of the green tea catechins (+)-catechinand(-)-epigallocatechin gallate. (Translated from eng)Eur J Pharm Sci 41(2)219-225(in eng)，


本发明涉及了一种茶多酚壳聚糖纳米粒制备方法及应用，更具体的说，涉及一种新的茶多酚纳米粒，该纳米粒由下述重量份的组分制成壳聚糖3～6份、多孔二氧化硅1～2份、茶多酚1～4份。本发明茶多酚纳米粒中加入多孔二氧化硅可以显著增加茶多酚在纳米粒中的含量。本发明采用三聚磷酸钠(TPP)离子凝胶法制备茶多酚壳聚糖纳米粒。本发明纳米粒可以广泛应用于生物医药和保健品的各个领域，可用于降血脂用于肥胖症的治疗、抗氧化清除自由基、预防和治疗肿瘤。