专利名称：一种从雪峰干酵母中分离乙醛脱氢酶的方法乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)广泛存在于真核生物和原核生物中，在辅酶I存在的条件下，它催化某些醛和酮的脱氢反应。在人类和其他许多动物体内， 线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醛类转化。人体由肠道吸收摄入的乙醇，主要在肝脏内代谢。乙醇进入体内后，首先在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下使乙醇脱氢转化为乙醛， 然后在由乙醛脱氢酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛被氧化生成乙酸，乙酸通过三羧酸循环 (TCA)分解为(X)2和水，并释放能量生成ATP。人体中，一般都存在前一种酶，而且数量基本是相等的。但缺少后一种酶的人就比较多，在亚洲地区，50%的人缺少ALDH。ALDH的缺少， 使乙醇不能被完全分解为水和CO2,以乙醛的形式继续留在体内。乙醛是毒性很强的物质， 可以共价结合微粒体蛋白形成乙醛蛋白络合物，抑制肝细胞合成蛋白的排出，最终造成人体酒精性肝病的发生。而且乙醛还在体内通过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化合物，导致膜脂质过氧化生成丙二醛和壬烯，它们可以进一步促进肝细胞释放因子，破坏细胞膜。当乙醛在体内累积过多时，会使人酒后产生脸红、恶心、呕吐、全身出汗、肌肉抽搐等症状，严重时会导致休克。乙醛在体内是潜在的致癌物质，能引起体内口腔、食道、肠道、肝脏癌型。因此， 乙醛在ALDH的催化作用下氧化分解至关重要。ALDH由于存在特殊的催化作用，在社会生产和日常生活中的应用将日益广泛。现有技术中，制备ALDH遇到的一个问题是用研磨和色谱柱技术从动植物细胞中分离提取，费用高、纯化产率低、ALDH含量少，难以大规模生产。在制备ALDH遇到的另一个问题是现有的商品ALDH主要是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中分离提取，资源有限且价格昂贵，极大地阻碍了这一产品的应用价值。
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从雪峰干酵母中分离乙醛脱氢酶的方法。该方法使用超声波破碎法来破碎雪峰干酵母细胞得到粗酶液ALDH，并用硫酸铵沉淀和kphadex G-75分离纯化粗酶液ALDH，可以得到纯化倍数较高、活力较大、分子量分布在57kDa左右的ALDH，所得产品可以应用于一般食品生产、医疗领域以及基因工程当中， 特别适用于解酒产品的开发。实现本发明目的所采用的技术方案包括一种从雪峰干酵母中分离乙醛脱氢酶的制备方法，包括如下步骤(1)将雪峰干酵母加入水中混勻，在30°C 40°C的水浴中孵育10mirT20min，再高速离心后取沉淀即得湿酵母；其中雪峰干酵母的重量与水的体积比为59Γ15% ；(2)将该湿酵母加入浓度为0.05mol/L、pH为7. 5^8. 5的磷酸盐缓冲液中配制成菌悬液，将该菌悬液超声波破碎后，离心，收集上清液，即为粗酶液；其超声波破碎的条件为处理量为15mL 25mL、温度1°C 8°C、超声功率为250W 350W、每次超声时间广4s、间隔时间广8s、总的超声时间l(T20min ；湿酵母的重量与磷酸盐缓冲液的体积比为15°/Γ25% ；(3)将饱和度为30%飞0%的硫酸铵加入上述所得的粗酶液中，离心，取其上清液，再将饱和度为659Γ85%的硫酸铵加入该上清液中，离心，取其沉淀，并向该沉淀中加入磷酸盐缓冲液，待沉淀完全溶解后，分离，即可得到所需的乙醛脱氢酶酶。所述步骤(1)中雪峰干酵母的重量与水的体积比为89Γ12%。所述步骤(1)中雪峰干酵母孵育的水浴温度为33°C 37°C，孵育时间为 13min 17min。所述步骤(2)中湿酵母的重量与磷酸缓冲液的体积比为189Γ22%。所述超声波破碎的处理量为18m广22mL。所述磷酸缓冲液的pH值为7. 8 8. 2。 所述超声波破碎的温度为2。C~6。C。所述超声波破碎的功率为280W 320W。所述每次超声波破碎的时间为广3s、间隔时间为广5s、总时间为12 18min。所述步骤(4 )中粗酶液经两次分级沉淀的硫酸铵饱和度分别为359Γ55%和 709^80%。由于一般酵母的细胞壁较厚，ALDH容易受外部极端环境影响而失去活性，因此筛选出对ALDH活力影响小的酵母细胞破碎方法是解决问题的关键。破碎酵母细胞壁除有反复冻融法、化学渗透法、研磨法、超声破碎法等，其中超声破碎法是利用超声波的空化效应、机械效应将酵母的细胞壁破碎，这一方法与其他方法相比，对细胞破碎效果好，对ALDH活力影响小的特点。本发明的关键是超声破碎雪峰干酵母细胞。超声破碎是一种利用超声波的空化效应和机械效应达到有效破碎酵母细胞释放ALDH的目的，配合降温措施可较有效保存ALDH 的活力。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果
1.本发明中使用的酵母为雪峰干酵母，为面包酵母，可食用，并且易培养，周期短，价格低廉，有利于降低生产成本。2.本发明用超声波破碎雪峰干酵母释放ALDH，从而提高了细胞破碎效果，有效保存了 ALDH的活力，提高了酵母利用率。3.本发明制取的ALDH的品质可达到或超过国内同类产品，提取ALDH后的酵母仍可以作为他用如制饲料、提蛋白等，既提高了酵母的利用价值，又提供了一种具有自主知识产权的ALDH的制取方法。

第一步取一定量的雪峰干酵母按8% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育15min,制得菌悬液。将菌悬液于4°C、5000r/min、离心5min，弃上清液，蒸馏水清洗1次，再次离心，取沉淀即湿酵母，并保存于4°C冰箱备用。第二步将湿酵母按质量体积比20%(W/V)重悬浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超声波破碎，条件处理量20mL、功率300W、破碎时间3s、间隙时间Is、总时间15min。将破碎液于4°C、5000r/min条件下离心15min,收集上清液，即为ALDH粗酶液，经检测ALDH的活力达到0. 46U/mg。第三步将上述ALDH粗酶液经饱和度为35%的硫酸铵沉淀室温静置lh，IOOOOr/ min离心lOmin，收集上清，经饱和度为70%的硫酸铵沉淀室温静置lh，10000r/min离心 lOmin，收集沉淀，加入5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0. 05mol/L pH7. 5)，将沉淀溶解，经检测 ALDH的比活力达到1. 03U/mg。第四步将上述收集的沉淀溶解液经kphadex G_75分离，洗脱液为磷酸盐缓冲液(浓度0. 05mol/L, ρΗ7· 5)，流速为0. 4mL/min,收集洗脱峰，经测定ALDH的比活力达到 1. MU/mg，经电泳测定和标准品有共同的条带，并且测定的ALDH分子量为57kDa左右。实施例2
第一步取一定量的雪峰干酵母按10% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌悬液。将菌悬液于4°C、5000r/min、离心5min，弃上清液，蒸馏水清洗1次，再次离心，取沉淀即湿酵母，并保存于4°C冰箱备用。第二步将湿酵母按质量体积比20% (W/V)重悬浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 0)中，于冰水浴中超声波破碎，条件处理量20mL、功率300W、破碎时间3s、间隙时间Is、总时间15min。将破碎液于4°C、5000r/min条件下离心15min,收集上清液，即为ALDH粗酶液，经检测ALDH的活力达到0. 48U/mg。第三步将上述ALDH粗酶液经饱和度为35%的硫酸铵沉淀室温静置lh，IOOOOr/ min离心lOmin，收集上清，经饱和度为70%的硫酸铵沉淀室温静置lh，10000r/min离心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0. 05mol/L pH8. 0)，将沉淀溶解，经检测 ALDH的比活力达到1. 07U/mg。第四步将上述收集的沉淀溶解液经kphadex G_75分离，洗脱液为磷酸盐缓冲液(浓度0. 05mol/L, ρΗ8· 0)，流速为0. 4mL/min,收集洗脱峰，经测定ALDH的比活力达到 1. 27U/mg，经电泳测定和标准品有共同的条带，并且测定的ALDH分子量为56kDa左右。实施例3
第一步取一定量的雪峰干酵母按12% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌悬液。将菌悬液于4°C、5000r/min、离心5min，弃上清液，蒸馏水清洗1次，再次离心，取沉淀即湿酵母，并保存于4°C冰箱备用。第二步将湿酵母按质量体积比20% (W/V)重悬浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 5)中，于冰水浴中超声波破碎，条件处理量20mL、功率300W、破碎时间3s、间隙时间Is、总时间15min。将破碎液于4°C、5000r/min条件下离心15min,收集上清液，即为ALDH粗酶液，经检测ALDH的活力达到0. 50U/mg。第三步将上述ALDH粗酶液经饱和度为35%的硫酸铵沉淀室温静置lh，IOOOOr/ min离心lOmin，收集上清，经饱和度为70%的硫酸铵沉淀室温静置lh，10000r/min离心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0. 05mol/L pH8. 5)，将沉淀溶解，经检测ALDH的比活力达到1. 09U/mg。第四步将上述收集的沉淀溶解液经kphadex G_75分离，洗脱液为磷酸盐缓冲液(浓度0. 05mol/L, pH8. 5)，流速为0. 4mL/min,收集洗脱峰，经测定ALDH的比活力达到 1. 30U/mg，经电泳测定和标准品有共同的条带，并且测定的ALDH分子量为57kDa左右。实施例4
第一步取一定量的雪峰干酵母按14% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌悬液。将菌悬液于4°C、5000r/min、离心5min，弃上清液，蒸馏水清洗1次，再次离心，取沉淀即湿酵母，并保存于4°C冰箱备用。第二步将湿酵母按质量体积比20% (W/V)重悬浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超声波破碎，条件处理量20mL、功率300W、破碎时间3s、间隙时间Is、总时间15min。将破碎液于4°C、5000r/min条件下离心15min，收集上清液，即为ALDH粗酶液，经检测ALDH的活力达到0. 45U/mg。第三步将上述ALDH粗酶液经饱和度为35%的硫酸铵沉淀室温静置lh，IOOOOr/ min离心lOmin，收集上清，经饱和度为70%的硫酸铵沉淀室温静置lh，10000r/min离心 IOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0. 05mol/L pH7. 5)，将沉淀溶解，经检测 ALDH的比活力达到1. 03U/mg。第四步将上述收集的沉淀溶解液经kphadex G_75分离，洗脱液为磷酸盐缓冲液(浓度0. 05mol/L, pH7. 5)，流速为0. 4mL/min,收集洗脱峰，经测定ALDH的比活力达到 1. 22U/mg，经电泳测定和标准品有共同的条带，并且测定的ALDH分子量为56kDa左右。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


本发明公开了一种从雪峰干酵母中分离乙醛脱氢酶的制备方法，包括如下步骤将雪峰干酵母加入水中，孵育，得湿酵母并加入磷酸盐缓冲液中配制成菌悬液，将该菌悬液超声波破碎后，离心，收集上清液，即为粗酶液；将饱和度为30%~60%的硫酸铵加入上述所得的粗酶液中，离心，取其上清液，再将饱和度为65%~85%的硫酸铵加入该上清液中，离心，取其沉淀，并向该沉淀中加入磷酸盐缓冲液，待沉淀完全溶解后，分离，即可得到所需的乙醛脱氢酶酶。本发明突破了乙醛脱氢酶来源的局限性，实现了原料的来源广、价格低廉和易培养，具有产品活性高、产品纯度高和反应过程简单可控的优点。