专利名称：合成的肌肉抑制素肽拮抗剂的制作方法肌肉抑制素拮抗剂肽在本领域是已知的并且通常利用重组技术来产生。然而，重组方法通常包括使用可能难以除去、从而保留在生物活性分子上的标签序列(tagsequence)0不清楚这类标签序列是否干扰生物活性。此外，通常在细菌例如大肠杆菌(E. coli)中进行重组技术，这可导致影响重组分子在哺乳动物系统中的生物活性的细菌翻译后修饰。细菌产生的重组肽还可在它们的三维结构上发生变化，因为不可能在这样的细菌系统中控制半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的形成。这导致相同重组产生的肽的产生的不一致，所得的生物活性具有差异性。由于这些原因，期望使用用于合成肌肉抑制素拮抗剂以确保产生不具有标签序列或细菌翻译后修饰的“干净”肽的合成方法。然而，其它问题因肽合成仪的使用而产生。具有多个半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和色氨酸残基的肽难以合成，即使它们可成功地合成，通常也是不溶性的，从而不可能体内使用。除了合成问题以外，还存在其它合成后加成化合物形成和与肽相关的修饰问题。通常将合成肽冻干，作为干粉于-20° C至-70° C下贮存。即使在这些条件下，肽亦可降解，尤其是含半胱氨酸的肽。此外，具有多个半胱氨酸残基的肽可具有多个连接性，从而产生生物活性和非活性肽的混合物。由于合成肽的产生昂贵并且通常只有极少量被合成，因此包含连接性的混合物的合成肽可能不包含足够量的活性形式而具有生物活性。肌肉抑制素肽包含多个半胱氨酸残基，因此在合成生物活性肽中出现许多困难。然而，如上所述，重组肽因标签序列的存在而不理想和/或微生物翻译后修饰可呈现对开发用于临床用途的肌肉抑制素拮抗剂的调节阻碍，获得正确三维结构中的问题意味着重组产生的肽可能无活性或完全无活性。因此存在对具有生物活性的“干净”合成肽的需求。因此，本发明的目的是提供用于治疗肌肉抑制素相关病症的具有拮抗剂活性的合成肽和/或为公众提供有用的选择。
本发明涉及具有肌肉抑制素拮抗剂活性的新型合成肽。在第一实施方案中，本发明提供了具有肌肉抑制素拮抗剂活性的合成肽，其具有对应于SEQ ID NO: I的成熟肌肉抑制素肽的至少5个连续氨基酸的氨基酸序列，其中合成肽包含至少两个位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸被强制键合并形成二硫键，或其功能变体或片段。优选地，本发明的合成肽包含SEQ ID NO: I的至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个或至少60个连续氨基酸。优选地，本发明的合成肽包含对应于SEQ ID NO: I的C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于氨基酸282和335或这两个氨基酸之间，所述肽包含至少两个在位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基被强制键合并形成二硫键；或其功能变体或片段。SEQ ID NO: I的肌肉抑制素氨基酸序列包含具有375个氨基酸的前体肌肉抑制素蛋白。活性成熟C末端肌肉抑制素蛋白在Arg 266处通过弗林蛋白酶(furin)内切蛋白酶的作用被切割。 因此本发明的优选活性合成肽包含对应于SEQ ID NO: I的位置267至C末端截短位置的至少5个连续氨基酸的氨基酸序列。任选地，所述肽可包括位于位置268或280上或这两个位置之间的N末端截短。SEQ ID NO: I的氨基酸位置272、281、282和309上的半胱氨酸残基分别为半胱氨酸1、2、3和4。存在于合成肽上的其它半胱氨酸残基被顺序编号，这对于本领域技术人员来说是理解的。本发明涉及使至少两个半胱氨酸残基键合以形成二硫键的合成肽，其中二硫键连接性位于半胱氨酸2与3之间。该连接性被认为不是天然连接性并且这两个半胱氨酸残基在合成过程中被强制键合。合成肽可选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列或其功能变体或片段，其中C末端载体位于SEQ ID N0:1的氨基酸位置282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334 或 335 上。优选地，本发明的合成肽选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列或其功能变体或片段、或与其具有实质性序列同源性的肽，其中所述C末端截短位于氨基酸位置 329、320、310、300、295、289、284 或 282 上(SEQ ID N0S: 2-9) 更优选地，本发明的合成肽选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于氨基酸位置320、310或300上(SEQ ID N0S:3_5)，或其功能变体或片段、或与其具有实质性序列同源性的肽。最优选地，本发明涉及合成的310截短肽(SEQ ID NO:4)。该肽包含4个半胱氨酸残基(分别为半胱氨酸1、2、3和4)。由于本发明的肽具有强制的2-3连接性，因此该优选合成肽可以只包含2-3连接性(当I和4半胱氨酸残基保持被保护时)或可包括2-3/1-4连接性的混合物。如本领域技术人员所理解的，一些方法可期望作为产生本发明的合成肽序列的方法以产生具有选择性改变的结合特征或具有改善的生物分布或体内半衰期或贮存期、或提高的稳定性的肌肉抑制素拮抗剂，包括糖基化、PEG化、法尼基化、乙酰化、生物素化、D氨基酸置换或有机衍生化(derivatization),所述肌肉抑制素拮抗剂。本发明还提供了合成具有肌肉抑制素拮抗剂活性的肽的方法，所述肽具有对应于SEQ ID N0:1的成熟肌肉抑制素肽的至少5个连续氨基酸的氨基酸序列，其中对半胱氨酸残基进行保护和去保护以强制形成半胱氨酸2与3(位置281和282上)之间或半胱氨酸2与3之间和半胱氨酸I与4(分别在位置281和282上以及位置272和309上)之间的二硫键连接性。本发明还提供了包含至少一种本发明的合成肽和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供了调节动物的肌肉生长、促进脂肪形成分化和/或促进骨生长或矿化的方法，所述方法包括给所述动物施用有效量的至少一种本发明的合成肽。优选地，所述方法可用于在绵羊、牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠、猫、狗或人中增加肌肉质量，减少脂肪沉积和/或改善骨生长。动物可具有正常或异常水平的肌肉抑制素。在具有正常水平的肌肉抑制素的动物中，利用本发明的拮抗剂的处理可导致增加的肌肉质量。在具有异常肌肉质量的动物中，这样的处理可导致肌肉质量的增加并且在肉类生产工业中是特别有用的。在具有减少的肌肉 质量(因肌肉损伤或创伤，因卧床休息而消耗等引起的)的动物中，利用本发明的拮抗剂的处理可将肌肉质量恢复至正常。在具有异常肌肉抑制素水平的动物中，肌肉质量将一直减少，并且利用本发明的肌肉抑制素拮抗剂的处理将使肌肉质量恢复至正常水平。本发明还提供了预防、治疗或减轻患者中的肌肉抑制素相关病理性病况的严重度的方法，其中所述病况的特征至少部分在于肌肉或脂肪组织的异常量、发育或代谢活性，其中所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的至少一种本发明的合成肽。病理性病况可包括与肌肥大相关的病症；与炎性肌病(inflammatorymyopathies)、肌营养不良、运动神经元病、神经肌肉接点的疾病、周围神经的疾病、因内分泌异常而引起的肌病、代谢综合征、HIV、癌症、少肌症、恶病质、休止状态(inactivity)或长期卧床休息以及其它消瘦病况相关的肌肉萎缩和肌萎缩；心力衰竭；骨质疏松症；肾衰竭或肾疾病；肝衰竭或肝疾病；厌食症；肥胖症；糖尿病；和伤口愈合。作为另一替代，可将本发明的合成肽缀合至另一种药学活性化合物以通过递送第二化合物来增强对靶细胞或组织的治疗效果，以试图治疗上述疾病或治疗适应症。在这类组合中，可单独地和相继施用或共施用本发明的肌肉抑制素拮抗剂。本发明还提供了调节动物的肌肉生长的方法，包括给所述动物施用有效量的至少一种本发明的合成肽。优选地，所述方法可用于在绵羊、牛、鹿、家禽、火鸡、猪、马、小鼠、大鼠、猫、狗或人中产生增加的肌肉质量。示例性定义除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和组合物相似或等同的任何方法和组合物可用于实施或测试本发明，但本文中描述了优选方法和组合物。为了本发明的目的，下面定义下列术语本说明书和权利要求中贯穿使用的“肥大(Hypertrophy)”意指细胞尺寸的任何增加。本说明书和权利要求中贯穿使用的“增生”意指细胞数目的任何增加。本说明书和权利要求中贯穿使用的“肌肉萎缩”意指因缺乏使用而引起的肌肉组织的任何消耗或损失。
本说明书和权利要求中贯穿使用的“少肌症”意指因老年引起的肌肉质量的减少和性能的减退以及特征在于肌肉萎缩和卫星细胞(satellite cell)被激活的能力的下降的少肌症相关或其它年龄相关肌肉病症。本说明书和权利要求中贯穿使用的肌肉抑制素的“抑制剂”或“拮抗剂”意指用于整体或部分减弱肌肉抑制素的活性的任何化合物。“肌肉生长”被理解为表示肌肉细胞的分裂和/或分化，包括任何前体细胞的分裂和/或分化，这类细胞彼此之间的融合和/或与存在的肌纤维的融合，其还包括肌纤维中增加的蛋白质合成，从而导致更高的蛋白质含量和更大的肌纤维体积(肌纤维肥大)。本文中所使用的“肽”或“多肽”被理解为意指合成产生的通过肽键共价连接的天然存在的和/或人工氨基酸的聚合物。不包括已从天然存在的来源分离的或使用重组技术产生的多肽。术语“片段或变体”将被理解为意指已通过一个或多个氨基酸的置换、插入或缺失 而修饰的，但与未修饰的序列或部分序列具有基本上相同的活性或功能的任何多肽序列或部分序列。优选地，变体包含保守置换。“保守置换”是这样的置换氨基酸被置换为具有相似性质的另一个氨基酸，这使得肽化学领域中的技术人员将预期多肽的二级结构和水疗性质(hydropathic nature)基本上不改变。通常可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质来进行氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值不带电荷的的极性头基(headgroup)的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其它氨基酸的组包括(l)ala、pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr ； (2) cys、ser、tyr、thr ； (3) val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his ;和(5)phe、tyr、trp、his。氨基酸可根据它们侧基的性质来进行分类。具有非极性烷基侧基的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。丝氨酸和苏氨酸在其侧链具有羟基，因为羟基是 极性的并且能够形成氢键，因此这类氨基酸是亲水性的。硫基团可见于甲硫氨酸和半胱氨酸中。羧酸基团为天冬氨酸和谷氨酸的侧链的一部分，由于羧酸基团的酸性的原因，所述氨基酸不仅具有极性而且还可在溶液中变得带负电荷。除侧链包含酰胺基团外，谷氨酰胺和天冬酰胺与谷氨酸和天冬氨酸相似。赖氨酸、精氨酸和组氨酸在它们的侧链中具有一个或多个氨基，所述氨基可接受质子，从而这类氨基酸用作碱。芳香基可见于苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的侧链上。酪氨酸因其羟基而具有极性，但色氨酸和苯丙氨酸为非极性的。变体还可以或可选择地包含非保守变化。本发明的合成肽或其功能变体或片段具有拮抗肌肉抑制素活性的生物功能。为了确定本发明的合成肽或其功能变体或片段是否能够拮抗肌肉抑制素活性，可通过在本发明的候选合成肽存在或不存在(对照)的情况下培养成肌细胞来测试这样的活性。与未接受候选肽的对照成肌细胞相比较，产生肌肉抑制素并从而限制它们自已的增殖率的成肌细胞的生长的增加表明所述肽具有肌肉抑制素拮抗性活性。合适的细胞系可以是鼠C2C12成肌细胞(ATCC N0:CRL-1772)，然而，应理解，可使用任何合适的成肌细胞系，例如原代羊、牛、猪或人成肌细胞。
本说明书和权利要求中使用的术语“包含”意指“至少部分由……组成”，即，当解释包括该术语的独立权利要求时，每一个权利要求中以该术语作前序的所有特征全都必须存在，但其它特征也可存在。本文中使用的术语“基本上对应于”、“基本上同源的”或“基本上的同一性”表示氨基酸序列的特征，其中选择的氨基酸序列与选择的参照氨基酸序列相比较具有至少约70%或约75%的序列同一性。更常见地，选择的序列与参照序列具有至少约76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84% 或甚至 85% 的序列同一1注，更优选至少约 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性。更优选地，高度同源的序列通常还在选择的序列与与其相比较的参照序列之间共有大于至少约96%、97%、98%或99%的序列同一性。可计算待比较的序列的全长上的序列同一性百分率，或同一性百分率可以通过排除总共少于约25%左右的选择的参照序列的小缺失或添加来进行计算，例如使用对于本领域技术人员来说是熟知的序列比较算法，例如Pearson和Lipman (1988)描述的FASTA程序分析，以及根据国立卫生研究院/NCBI数据库(Bethesda，MD ;参见互联网:>www. ncbi. nlm. nih. gov/cRi-bin/BLAST/nph-newblast)提供的默认权重对序列空位和序列错配进行加权处理的空位BLAST算法(例如，Altschul等)。 提及本文中公开的一个范围的数字(例如I至10)也意欲包括提及该范围内的所有相关数字(例如，I、I. 1、2、3、3. 9、4、5、6、6. 5、7、8、9和10)以及还有该范围内的任何有理数范围(例如2至8，I. 5至5. 5和3. I至4. 7)，从而明确地公开了本文中明确公开的所有范围的所有子范围。这些仅是什么为明确期望的实例，并且列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合将被认为是以类似方式在本申请中明确记载的。发明详述本发明涉及用于治疗肌肉抑制素相关病症的具有肌肉抑制素拮抗剂活性的新型合成肽。具体地，本发明提供了具有肌肉抑制素拮抗剂活性的合成肽，其具有对应于SEQID NO: I的成熟肌肉抑制素肽的至少5个连续氨基酸的氨基酸序列，其中合成肽包含至少两个位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸被强制键合并形成二硫键，或其功能变体或片段。优选地，本发明的合成肽包含SEQ ID NO: I的至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个或至少60
个连续氨基酸。优选地,本发明涉及肌肉抑制素的新型合成显性阴性(dominant negative),其包含对应于在SEQ ID NO: I的氨基酸位置282或335上的或这两个氨基酸位置之间的位置上具有C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列，所述肽包含至少两个位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基被强制键合并形成二硫键，或其功能变体或片段。肌肉抑制素蛋白最初被翻译为375个氨基酸的前体分子，该分子在N端具有分泌信号序列、弗林蛋白酶(furin)内切蛋白酶的蛋白水解加工信号(RSRR)和C末端区域中的9个保守半胱氨酸残基，以促进“半胱氨酸纽结”结构的形成。肌肉抑制素在Arg 266通过弗林蛋白酶内切蛋白酶切割而被激活，从而释放N末端或“潜伏相关肽”(LAP)和成熟C末端结构域，所述结构域二聚化形成活性肌肉抑制素分子。在加工后，LAP肽的同二聚体保持非共价结合至以无活性复合物形式存在的成熟肌肉抑制素的同二聚体(Lee等人，2001)。人肌肉抑制素前体蛋白分子的氨基酸序列示于SEQ ID NO: I。包含成熟肌肉抑制素肽的肌肉抑制素拮抗剂(其在氨基酸位置330或350上被C末端截短)是已知的(W0 2001/53350)。这类拮抗剂在这样的位置上被截短，以便可能在确定它们的三维结构和与其它分子的结合相互作用中起着重要作用的关键半胱氨酸得到保留。预期这类关键半胱氨酸残基的丢失会对它们发挥功能的能力造成不利影响(Jeanplong等人，2001)。然而，已显示在靠近或不包括半胱氨酸残基的位置上的C末端截短的成熟重组肌肉抑制素肽是有生物活性的(W0 2008/016314)。W02008/016314教导为了保持生物活性，重组C截短成熟肌肉抑制素肽中需要至少两个半胱氨酸部分，虽然生物活性肽的确切构象形式还不清楚。WO 2008/016314还认为重组产生的肽是保留生物活性所必需的，因为不能产生具有任何生物活性的合成形式。
令人惊讶地，第一次显示可合成生物活性的C末端截短成熟肌肉抑制素肽。此外，第一次显示了需要合成这样的合成的肌肉抑制素肽以获得生物活性SEQID NO: I的位置281和282上的半胱氨酸残基被强制键合并且形成二硫键。这类半胱氨酸残基是本发明的肽序列中的第二和第三半胱氨酸，并且可称为2-3连接性。由于这些半胱氨酸残基并排存在于氨基酸序列中，因此它们不可能天然地键合在一起，从而必须对本发明的合成肽中的半胱氨酸残基进行保护和去保护以强制产生2-3连接性。由于该连接性不可能存在于天然或重组肌肉抑制素肽中，所以该结果是高度令人惊讶的。本发明的合成肽包含对应于由SEQ ID NO: I的氨基酸267 (切割位点)至335组成的序列的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸，包括如下的位点281和282上的半胱氨酸残基I2 3Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro270275280285Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr29029530045Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305310315320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325330335本发明的合成肽可包含2至5个半胱氨酸残基，这取决于截短位置(从氨基酸282至335)。半胱氨酸残基键合以形成二硫键。存在许多可选择的二硫化物连接，这可能取决于存在于本发明的合成肽中的半胱氨酸残基的数目。当截短位置位于氨基酸282和308上或这两个氨基酸之间时，合成肽包含3个半胱氨酸残基，从而可能的半胱氨酸连接包含1-2、1-3和2-3。当截短位置位于氨基酸309或312上或这两个氨基酸之间时，合成肽包含4个半胱氨酸残基，从而可能的半胱氨酸连接性包括1-2、1-3、1-4、2-3、2-4和3_4。
当截短位置在氨基酸313和335上或这两个氨基酸之间时，合成肽包含5个半胱氨酸，从而可能的半胱氨酸连接性包括1-2、1_3、1_4、1_5、2_3、2_4、2_5、3_4、3_5和4_5。天然肌肉抑制素C末端截短的肽可能包括所有可能的连接性的混合物。如本领域技术人员意识到的，正确的肽连接性对于生物活性是至关重要的，因为其决定生物活性所
需的三维结构。根据WO 2008/016314的教导，认为1_2连接性是生物活性所必需的，因为该公开内容显示位置281上的C末端截短的成熟重组肌肉抑制素肽具有生物活性。该重组肽只具有两个半胱氨酸残基并且只可形成1-2连接性，因此该连接性似乎对于肌肉抑制素生物活性是至关重要的。令人惊讶地，本发明人发现在281上具有截短位置的合成肽不具有生物活性。此夕卜，本发明人发现合成肽的生物活性需要至少两个半胱氨酸残基，还发现2-3连接性对于 本发明的合成肽的生物活性是至关重要的连接性。这一点是从WO 2008/016314的教导预料不到的。本发明人测试了所有其它可能的连接性并且发现1-2、1-3、1-4、2-4、3_4及其各种混合物不具有生物活性。然而，对应于310截短并且包含2-3/1-4连接性的混合物的合成肽具有生物活性。这被认为是主要归因于2-3肽的存在。因而本发明提供了具有肌肉抑制素拮抗剂活性的合成肽，所述合成肽具有对应于SEQ ID N0:1的成熟肌肉抑制素肽的至少5个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述合成肽包含至少两个位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱酸被强制键合并形成二硫键，或其功能变体或片段。优选地，本发明的合成肽包含SEQ ID NO: I的至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个或至少60
个连续氨基酸。优选地，本发明提供了具有肌肉抑制素拮抗剂活性的合成肽，其包含对应于SEQID N0:1的C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于氨基酸282和335上或其之间，所述肽包含至少两个位置281和282上的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸被强制键合并形成二硫键，或其功能变体或片段。本发明的肽从而包含2-3连接性。本发明的合成肽还可包含2-3/1-4连接性的混合物。本发明的合成肽可选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于SEQ ID NO: I的氨基酸位置282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334 或 335，或其功能变体或片段。优选地，本发明的合成肽选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素多肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于氨基酸位置329、320、310、300、295、289、284或282上(SEQID N0S: 2-9)，或其功能变体或片段，或与其具有实质性序列同源性的多肽。更优选地，本发明的合成肽选自对应于C末端截短的成熟肌肉抑制素多肽的氨基酸序列，其中所述C末端截短位于氨基酸位置320、310或300上(SEQ ID N0:3、4或5)。可以以许多方式改变本发明的合成肽以产生具有改善的药代动力学的变体，这对于本领域技术人员来说是理解的。例如，可添加改变极性和/或形成氢键能力的官能团，并且所述官能团可改变合成肽的溶解度。类似地，官能团可通过改变血清半衰期(Werle等人，2006)或通过控制合成肽在靶位点上从胶束释放来改变稳定性。此外，官能团可以例如通过使合成肽对患者的副作用减小至最小来改变生物相容性。能够结合靶细胞或组织或促进至靶细胞内的转运的官能团的添加将增强合成肽的递送和靶向。 缀合至本发明的合成肽的官能团可以是结合特定生物物质或位点的生物靶向性分子。生物物质或位点为期望的递送的靶点和与其结合的靶向性分子，这使得合成肽能够被递送至目标组织或细胞。配体可用作生物靶向分子，通过选择性结合另一种物质或具有对另一种物质的特异性亲和力。配体被特异性结合抗体或结合伴侣或受体识别且结合。适合用于靶向的配体的实例包括抗原、半抗原、生物素、生物素衍生物、植物凝集素、半乳糖胺和岩藻糖基胺部分、受体、物质、辅酶和辅因子等等。可用作递送和靶向的配体的其它物质是某些留类、前列 腺素、碳水化合物、脂质、某些蛋白质或蛋白质片段(即激素、毒素)和具有细胞亲和力的合成或天然多肽。配体还包括具有对于连接者(Iigator)的选择性亲和力的各种物质,其通过重组DNA、遗传和分子工程产生。另一种类型的靶分子为抗体，该术语在本文中用于包括所有种类的抗体，单克隆抗体、嵌合抗体、其Fab级分、片段和衍生物。其它靶向性分子包括酶，尤其细胞表面酶例如神经氨酸酶、血浆蛋白质、亲和素、链霉亲和素、抑素、cavitand、甲状腺球蛋白、内因子、球蛋白、螯合剂、表面活性剂、有机金属物质、葡萄球菌蛋白A、蛋白G、细胞色素、植物凝集素、某些树脂和有机聚合物。靶向性分子可包括肽，包括蛋白质、蛋白质片段或多肽，其可通过合成产生或通过本领域已知的重组技术产生。肽的实例包括可促进化合物至靶细胞内部的转移或用于核转位的膜转移蛋白质(参见W0 01/15511)。本发明的合成肽的其它修饰包括缀合至生物相容性聚合物例如聚乙二醇(PEG)和相关聚合物衍生物。药物-PEG缀合物被描述为改善缀合物在水解分解和随后释放结合分子之前的循环时间(延长血清半衰期)，从而增加药物功效。例如，US 6214966描述了PEG和相关聚合物衍生物缀合至药物例如蛋白质、酶和小分子以提高溶解度和促进药物的受控释放的用途。可选择地，EP 1082105 (W0 99/59548)描述了生物可降解聚酯聚合物作为药物递送系统以促进缀合的药物的受控释放的用途。作为另一种选择，可将本发明的合成肽缀合至另一种药学活性化合物，以通过一起递送具有相似的肌肉抑制素拮抗作用或不同活性的第二化合物来增强对靶细胞或组织的治疗效果。例如，US 6，051，576描述了共同药物(co-drug)制剂通过经由不稳定连接缀合两种或更多种试剂以提高药理学活性化合物的药学和药理学性质的用途。例如，第二肌肉抑制素拮抗剂可选自任何一种或多种已知的肌肉抑制素抑制剂。例如，US6096506和US6468535公开了抗-肌肉抑制素抗体。US 6369201和W001/05820教导了能够引发免疫反应和阻断肌肉抑制素活性的肌肉抑制素肽免疫原、肌肉抑制素多聚体和肌肉抑制素免疫缀合物。肌肉抑制素的蛋白质抑制剂公开于WO 02/085306中，其包括截短的活化素II型受体、肌肉抑制素前结构域和滤泡抑素(follistatin)。来源于肌肉抑制素肽的其它肌肉抑制素抑制剂是已知的，包括例如从过表达肌肉抑制素的细胞释放入培养物的肌肉抑制素抑制剂(W0 00/43781);肌肉抑制素的显性阴性(W0 01/53350)，其包括Piedmontese等位基因(位置313上的半胱氨酸被酪氨酸置换)和在氨基酸位置330和375上或所述两个氨基酸之间的位置上具有C末端截短的成熟肌肉抑制素肽。US2004/0181033还教导了包含氨基酸序列WMCPP的小分子肽，其能够结合并且抑制肌肉抑制素。可将对本发明的合成的肌肉抑制素拮抗剂肽具有不同活性的第二药理学活性化合物与本发明的合成肽结合使用以治疗肌肉抑制素相关病症。例如，可将合成肽与多肽生长因子、NSAID或C0X-2抑制剂、a和0阻断剂、ACE抑制剂、双磷酸酯、雌二醇受体调节齐U、抗高血压药、谷氨酸盐拮抗剂、胰岛素、抗生素、蛋白激酶C抑制剂或本领域技术人员理解的各种非处方药结合施用。提高稳定性和半衰期的其它修饰包括本发明的合成肽内的易感氨基酸蛋白酶切割位点的鉴定，和用替代氨基酸置换这类氨基酸以在体内防止血浆中合成肽的蛋白酶降 解。本领域技术人员将理解什么类型的官能团可被添加以在给患者施用合成肽时达到期望的结果，从而提高总体治疗指数。就它们在SEQ ID NO: I的肌肉抑制素的C末端部分上的位置显示了本发明中举例说明的具体的合成产生的C末端截短多肽。还包括这样的合成肽所述合成肽的序列与本发明的合成肽序列相差一个或多个保守氨基酸置换、缺失或插入，所述一个或多个保守氨基酸置换、缺失或插入不影响合成肽的生物活性。保守置换通常包括一个氨基酸对另一个具有相似特征的氨基酸的置换，例如下列组内的置换缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。保守置换的实例可获自下面表I。表I保守氨基酸置换


本发明涉及新型合成的肌肉抑制素拮抗剂，其包含合成的成熟的肌肉抑制素肽或其功能变体或片段，其中所述肽包含至少两个在位置281和282上被强制键合并形成二硫键的半胱氨酸，所述肽在治疗肌肉抑制素相关病症中是有用的。