专利名称：水产动物体外寄生虫防治剂及其制备方法 水产动物寄生虫防治，是水产养殖业经济效益的重要保障措施。水产动物寄生虫病发生率高、流行广泛，其中危害性最大的体外寄生虫有原虫类如车轮虫、小瓜虫；蠕虫类如指环虫、三代虫；甲壳动物如猫头鲺等。当前，敌敌畏、乙酰甲胺磷、孔雀石绿、硝酸亚汞等杀虫剂由于安全性差、污染环境和对人类潜在性的危害在水产上已被禁止使用。目前国内外防治水产动物寄生蠕虫类病多采用化学药剂如甲苯咪唑、吡喹酮、别丁、阿维菌素、福尔马林、敌百虫、拟除虫菊酯、染料亚甲基蓝、氧化剂高锰酸钾和重金属盐等物质。首先，这些药物一般均有强烈的刺激性或腐蚀性，使用后对水产动物的进食、生长有很大的影响，直接影响生产性能；另外，长期使用寄生虫已经产生抗药性；再有，这些物质在环境中不易降解，容易造成水源污染，其中一些物质还会造成生物富集，直接危及人类的食品安全和身体健康。随着水产养殖业的发展，养殖集约化程度越来越高，水产养殖中的病害发生呈严重趋势，而对常用的杀虫药物已产生了很高的抗药性，因此，开发出高效、对环境无污染的无公害植物质水产动物寄生虫防治剂就迫在眉睫。在我国，水产动物病害防治中有时使用中草药，关于药效、药理、毒性以及制剂等方面的研究才刚起步。利用中草药进行水产动物病害防治与化学药剂相比，有不影响水产品质量、无残留、无污染、对其不易产生抗药性、不影响水产动物的进食和生长、对水产动物安全等优点。
本发明的发明目的是提供一种以蛇床子提取物制备的水产动物体外寄生虫防治剂。本发明的另一发明目的是提供上述水产动物体外寄生虫防治剂的制备方法。本发明采取的技术方案是一种水产动物体外寄生虫防治剂，其特征在于，该防治剂由下列重量比的原料构成蛇床子提取物20％～75％，表面活性剂3％～10％，其余为溶剂，上述原料的总和为100％。所述的表面活性剂是二甲基亚砜和吐温-80混合物，其比例为3∶2或5∶1。所述的溶剂为乙醇或本领域技术人员熟知的其他溶剂。
实现上述水产动物体外寄生虫防治剂的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行A.将蛇床子果实粉碎，在60℃～70℃温度下用甲醇回流提取，浓缩提取液并蒸干甲醇呈流浸膏，用无水工业酒精萃取，浓缩萃取液至蛇床子果实干重的15％-25％，得蛇床子果实提取物；B.将表面活性剂、蛇床子果实提取物、乙醇按权利要求1的重量百分比加入匀质机中混合，温度控制在50℃～60℃，加工后冷却至常温，即得蛇床子提取物水产动物体外寄生虫防治剂。
本发明的使用法与用量直接泼洒于池塘中，使用剂量为2ml/m3。
经试验证实，利用植物质进行水产动物病害防治与化学药剂相比，有不影响水产品质量、无残留、无污染、对其不易产生抗药性、不影响水产动物的进食和生长、对水产动物安全等优点。本发明研制出纯植物源的水产动物体外寄生虫防治剂，试验表明，该药物对寄生在水产动物体外寄生虫特别是指环虫、拟指环虫、三代虫等蠕虫具有显著的杀灭作用，对水产动物及环境都非常安全，并且还有使用剂量低、成本小、使用方便等特点，在生产上完全可以替代化学杀虫剂，对环境无污染的无公害植物质水产动物寄生虫防治剂，广泛适用于对鳜鱼、鲈鱼、鲤、草鱼、鳗鱼、鲷、鲆等多种淡水、海水鱼类的体外寄生虫(原虫、蠕虫)的防治剂。具有较好的社会和经济效益。

为了更清楚的理解本发明以及本发明药剂的药效，以下通过发明人给出的依本发明技术方案所完成的具体的实施例对本发明作进一步的详细描述，这些仅是本发明较好的实施例，但不限于这些实施例。
实施例1水产动物体外寄生虫防治剂采用蛇床子果实经提取加工制得蛇床子果实提取物，所述的制剂的配方按下述质量百分比蛇床子果实提取物20份、表面活性剂5份，其余为乙醇或其他本领域熟知的溶剂，构成100份；表面活性剂为二甲基亚砜和吐温-80的混合物，其比例为3∶2。
其制备方法是，称取粉碎的蛇床子果实，在60～70℃温度下，用甲醇回流提取，浓缩提取液并蒸干甲醇，提取物呈流浸膏状，用无水工业酒精萃取，浓缩萃取液，获蛇床子果实浓缩液；取果实浓缩液20kg，表面活性剂二甲基亚砜和吐温-80混合物5kg，余为乙醇溶剂，加入匀质机中，温度控制在50℃～60℃，加工后冷却至常温，即得寄生虫防治剂100kg。
实施例2水产动物体外寄生虫防治剂采用蛇床子果实经提取加工制得蛇床子果实提取物，所述的制剂的配方按下述质量百分比蛇床子果实提取物50份、表面活性剂5份，其余为乙醇或其他本领域熟知的溶剂，构成100份；表面活性剂为二甲基亚砜和吐温-80的混合物，其比例为5∶1。制备方法同实施例1。
实施例3
水产动物体外寄生虫防治剂采用蛇床子果实经提取加工制得蛇床子果实提取物，所述的制剂的配方按下述质量百分比蛇床子果实提取物75份、表面活性剂10份，其余为乙醇或其他本领域熟知的溶剂，构成100份；表而活性剂为二甲基亚砜和吐温-80的混合物，其比例为5∶1。制备方法同实施例1。
实施例4水产动物体外寄生虫防治剂采用蛇床子果实经提取加工制得蛇床子果实提取物，所述的制剂的配方按下述质量百分比蛇床子果实提取物40份、表面活性剂8份，其余为乙醇或其他本领域熟知的溶剂，构成100份；表面活性剂为二甲基亚砜和吐温-80的混合物，其比例为3∶2。制备方法同实施例1。
实施例5水产动物体外寄生虫防治剂采用蛇床子果实经提取加工制得蛇床子果实提取物，所述的制剂的配方按下述质量百分比蛇床子果实提取物60份、表面活性剂3份，其余为乙醇或其他本领域熟知的溶剂，构成100份；表面活性剂为二甲基亚砜和吐温-80的混合物，其比例为3∶2。制备方法同实施例1。
上述实施例可以列举很多，再此不一一列举，从申请人所做的大量实验得到的数据证明，只要是按照本发明的技术方案的参数范围内选择，即可制备出达到本发明目的的水产动物寄生虫防治剂。
上述防治剂可直接泼洒于池塘中，使用剂量为2ml/m3，以下是本发明的药效的具体试验实例。
试验实施例11.1材料预试验健康金鱼苗购于咸阳某渔场，体重在0.8～2g/尾；鳗鱼由福建省福清市某鳗场提供。试验用蛇床子浸膏有西安鸿生生物技术有限公司提供，蛇床子素含量有西安交通大学药学院测定，含量为15.3％，用药浓度按蛇床子素(mg)/水体(L)计。
1.2方法1.2.1指环虫的感染由渔场运回后的鱼苗，首先用2mg/L盐酸环丙沙星进行细菌性疾病预防，通过3～5d养殖正常后，在水族箱中，采用特殊的方法将保存有指环虫的鱼鳃上的指环虫感染到健康鱼鳃上，并控制水温25℃左右，每天加一定量的新水，大约经过4～6d培养，对感染鱼随机抽样捞取镜检，如果感染率为100％、在10×4倍下每个视野内有6条以上指环虫时便进行药效试验。
1.2.2药效试验试验条件预试验在实验室进行，采用直径36cm、高11cm的白色搪瓷盆，试验用水为充分暴气的自来水5000ml、PH值为7.0-7.5，试验期水温变化为25±2℃。药效试验在福建某鳗场，用多个相同的水族箱加充分曝气的自来水1L，控制水温25±2℃，PH值为7.0～7.5，放养鱼后，含氧需在5mg/L以上。
试验药物浓度的确定和试验分组首先通过梯度递增法进行预试验，再在最小有效浓度、完全杀灭寄生虫有效浓度和最高有效剂量浓度范围附近按梯度递增的原则设立试验组，并设对照组。每个水族箱内，放养随机捞取感染的鱼20尾，在加药后24、48、72、96h时抽样解剖，取鳃制片，镜下观察寄生虫消失情况，并记录。各试验组重复3次。鱼中毒死亡率＝该时间段鱼死亡总数÷10尾×100％。
1.2.3急性毒性试验试验鱼的准备由于鳗鱼对药物比较敏感，所以试验用健康鳗鱼，体重在2.1-2.5g(小于5g)，首先在试验条件下养殖7d左右，每天投喂1-2次，投入的饲料在10min内吃完为限。待适应实验室环境条件后再进行毒性试验。
试验条件试验所用为静水式条件，水族箱内盛1L充分瀑气的自来水，控制水温为25±1℃，PH值为7.3，硬度65.6mg/L，碱度41.5mg/L，溶氧量为8.67mg/L，放养鱼后，要求保持水中溶氧在5mg/L以上。为了保持恒定的药物浓度，每隔24小时换药液一次。
试验药物浓度的设定首先，进行预备试验，确定试验液浓度的大致范围，然后，再根据梯度递增稀释法设立0.95、1.05、1.15、1.25mg/L不同浓度的试验组，在以上试验的基础上，在致死浓度1.05～1.15mg/L的范围内按对数等差值(0.01)插入三个浓度试验组(1.074、1.099、1.125mg/L)再次试验，以更准确的确定其致死浓度范围和毒性大小。试验中用随机的方法捞取培养鱼10尾按低浓度向高浓度递增的顺序放入，并设对照组。试验期间连续观察并记录各组96h内试验鱼的死亡时间。
最低致死浓度范围、半数致死浓度(TLm)及安全浓度计算2、4、8、24～96小时内，金鱼致死的最低浓度和下一个浓度为最低致死浓度范围，并计算致死率。利用概率单位目测法，求出半数致死浓度TLm，并根据Turbell公式计算安全浓度安全浓度＝(48h TLm×0.3)/(24h TLm/48h TLm)22.结果2.1.1药效预试验在多个白色搪瓷盆中，分别设立0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/L(相当于mg蛇床子素/L水体)不同浓度，在24h时，寄生虫在0.1mg/L无效果，0.6mg/L鱼全部鳃上寄生虫存活1～3条，0.9mg/L以上时寄生虫全部消失，1.2mg/L鱼中毒死亡率达60％，从1.5mg/L以上，24h内试验金鱼全部死亡，对刚死亡的鱼镜检，寄生虫全部死亡；在48h时，寄生虫在0.3mg/L有10～30％消失，0.6mg/L鱼全部鳃上寄生虫存活1～3条，0.9mg/L时鱼中毒死亡10％，1.2mg/L鱼中毒死亡80％，对刚死亡的鱼镜检，寄生虫全部死亡；在72h，0.3mg/L时鱼全部鳃上寄生虫存活0～3条；在96小时，0.3mg/L时鱼全部鳃上寄生虫存活0～2条。对照组杀虫无效，并且金鱼坏鳃指环虫数量有所增加。(结果见表1)表1.蛇床子提取液杀灭指环虫预试验

注-表示无效果；+表示鱼鳃有10～30％寄生虫减少；++表示寄生虫消失了50～70％；+++表示鱼全部鳃上寄生虫存活1～3条；++++寄生虫全部消失死亡。
2.1.2药效试验根据预试验，按欧鳗的拟指环虫与金鱼坏鳃指环虫设2个试验组。
试验组1试验材料为欧鳗的拟指环虫。在多个水族箱中，按倍数递增的方法分别使用0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10mg/L(相当于mg蛇床子素/L水体)，在24h时，寄生虫在0.2～0.5mg/L仅存活1～3条，0.6mg/L以上寄生虫全部死亡，鳗鱼从1.0mg/L开始出现中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分别为20％、50％；48时，从0.5mg/L以上寄生虫全部死亡，从0.9mg/L鳗鱼有中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分别为10、40、90％；72h，从0.9～1.10mg/L死亡率分别为20、50、100％；在96小时，药效开始减弱，无中毒鱼死亡(结果见表2)。所做的对照试验，经镜检发现，感染拟指环虫数量在24、48、72、96h后有所增加。
表2.蛇床子提取液对欧鳗拟指环虫按梯度递增浓度的效果试验


注-表示无效果；+表示鱼鳃有10～30％寄生虫减少；++表示寄生虫消失了50～70％；+++表示鱼全部鳃上寄生虫存活1～3条；++++寄生虫全部消失死亡。
试验组2试验材料为金鱼坏鳃指环虫.在多个水族箱中，按倍数递增的方法分别使用0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10mg/L(相当于mg蛇床子素/L水体)，在24h时，寄生虫在0.2～0.5mg/L仅存活1～3条，0.6mg/L以上寄生虫全部死亡，金鱼从1.0mg/L开始出现中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分别为10％、20％；48时，从0.5mg/L以上寄生虫全部死亡，从0.9mg/L金鱼有中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分别为10、30、40％；72h，从0.9～1.10mg/L死亡率分别为20、50、60％；在96小时，药效开始减弱，无中毒鱼死亡(结果见表2)。所做的对照试验，经镜检发现，感染指环虫数量在24h、48h、72h、96h后有所增加。
表2.蛇床子提取液对金鱼指环虫按梯度递增浓度的效果试验

注-表示无效果；+表示鱼鳃有10～30％寄生虫减少；++表示寄生虫消失了50～70％；+++表示鱼全部鳃上寄生虫存活1～3条；++++寄生虫全部消失死亡。
2.2.急性毒性试验2.2.1鳗鱼中毒反应在高浓度(1.25mg/L)试验液中鳗鱼中毒反应非常明显，用药后1h左右出现异常表现，鳗鱼将头窜出水面，或侧身在水底狂游，不久后开始出现麻痹，继而失去平衡，腹部朝上而死。低浓度试验液中(如0.95mg/L等浓度)，鳗鱼安静，无应激反应，活动正常。
2.2.2最低致死浓度范围和致死率鳗鱼在第2、4h最低致死浓度范围分别1.15～1.25mg/L和1.05～1.074mg/L，从第8h后降为0.95～1.05mg/L，致死率分别为100％、10％、20％、20％，在第24h到第96h致死率和最低致死浓度范围与第8小时相同。(见表4)。
表4.蛇床子提取液各浓度对鳗鱼的毒性反应

2.2.3半数致死浓度TLm和安全浓度利用概率单位目测法求第8小时半数致死浓度TLm为1.0965mg/L，第24-96小时的半数致死浓度TLm为1.0789mg/L。
计算Lc50的95％可信限

X是概率单位5.0处对应的浓度对数，2s是概率单位4.0与6.0处相应两个浓度对数的差，N为概率单位3.5～6.5范围内各组动物的总数[3]。
第8h ＝1.0845～1.1086mg/L第24～96h ＝1.0620～1.0962mg/L蛇床子素对鳗鱼安全浓度计算根据Turbell公式计算安全浓度安全浓度＝(48h TLm×0.3)/(24h TLm/48h TLm)2＝1.0789×0.3＝0.3237mg/L3结论3.1近年来，鳗用杀虫剂局限在咪唑类药物，开发面极其狭窄，开发的药物趋同化也造成了病原对药物的抗药性的时间迅速提前，大大减弱了防治效果[4]。本次试验通过从80多种植物提取物进行的杀灭指环虫的药效来看，天然植物蛇床子其有效提取成分蛇床子素有着显著的杀虫效果，而且用量低，有效使用浓度为0.2～0.6mg/L。同时，由于蛇床子素为植物提取物，抗药性极低，药用年限长。
3.2蛇床子素可以用来杀灭指环虫，对水生动物安全性高。因而，今后进一步纯化，或与其它药物进行合理配伍，以增强药效，降低毒性。为了提高我国水产品在世界上的竞争力，为了满足人类对“绿色水产品”的要求，应加快绿色、环保、无公害渔药的开发和研制。本试验所采用的蛇床子素为纯天然植物蛇床子提取物，它副作用小，无残留，不污染环境，对人类健康无害，是一种新型的绿色、环保、无公害渔药。
由于传统渔药自身存在的种种缺陷以及对人类健康的潜在威胁，一些国家已将鱼病防治的重点逐步转向新型无公害渔药开发。我国传统中药近年来在鱼病防治中的地位日见突起，其疗效好，毒副作用低的特点引起鱼病界的关注。因而，如何进一步提取植物中的有效成分，增强其防治效果，进行新型无公害渔药开发将是今后的工作重点。
参考文献1.农业部《渔药手册》编撰委员会.渔药手册.北京中国科技出版社，1998；2.邢华.渔药发展概况 中国水产，1996，(1)24-25；3.国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会编.水和废水监测分析方法.北京中国环境科学出版社；4.李学贵 凌伟专.几种药物对欧洲鳗鲡毒性及对拟指环虫病治疗效果的观察.福建水产，1997，(3)25-32；5.医学院卫生学教研室 卫生毒理实验方法.人民出版社，1980；6.赵文 孙兆和.精养条件下欧洲鳗的病害及防治.国外水产，1995，(4)20-24湖南。
试验实施例2蛇床子素制剂对鱼类指环虫拟指环虫杀灭试验1.1材料预试验用健康金鱼苗购于咸阳某渔场，体重在0.8～2g/尾；鳗鱼由福建省福清市某鳗场提供。试验用药为实施例1中寄生虫防治剂。
1.2方法1.2.1指环虫的感染由渔场运回后的金鱼苗，首先用2mg/L盐酸环丙沙星进行细菌性疾病预防，通过3～5d养殖正常后，在水族箱中，采用一定的方法将保存有指环虫的鱼鳃上的指环虫感染到健康鱼鳃上，并控制水温25℃左右，每天加一定量的新水，大约经过4～6d培养，对感染鱼随机抽样捞取镜检，如果感染率为100％、在10×4倍下每个视野内有6条以上指环虫时便进行药效试验。
鳗鱼由福建省福清市某鳗场空运到试验室，平均体重3.5g/尾，经检查感染率为100％、在10×4倍下每个视野内有10条以上拟指环虫。
1.2.2药效试验试验条件预试验在实验室进行，采用直径36cm、高11cm的白色搪瓷盆，试验用水为充分曝气的自来水5000ml、pH值为7.0-7.5，试验期水温变化为25±2℃。用多个相同的水族箱加充分曝气的自来水1L，控制水温25±2℃，pH值为7.0～7.5，放养鱼后，含氧需在5mg/L以上。
试验药物浓度的确定和试验分组首先通过梯度递增法进行预试验，再在最小有效浓度、完全杀灭寄生虫有效浓度和最高有效剂量浓度范围附近按梯度递增的原则设立试验组，并设对照组。每个水族箱内，放养随机捞取感染的鱼20尾，在加药后24、48、72、96h时抽样解剖，取鳃制片，镜下观察寄生虫消失情况，并记录。各试验组重复3次。
1.3试验结果1.3.1依照1.2.2的方法，进行药效试验，结果见表1。药液浓度以制剂的浓度计。
表1 48h时杀虫制剂防治水产动物寄生虫药效结果


本发明在筛选了大量植物的基础上，研制出纯植物源的水产动物体外寄生虫防治剂，试验表明，该药物对寄生在水产动物体外寄生虫特别是指环虫、拟指环虫、三代虫等蠕虫具有显著的杀灭作用、对水产动物及环境安全，并且使用剂量低、成本小、使用方便等特点，在生产上完全可以替代化学杀虫剂，来用于水产动物体外寄生虫病的防治。


本发明公开了一种蛇床子提取物水产动物体外寄生虫防治剂及其制备方法。制剂是由蛇床子(Cnidium monnieri (L.)Cuss)果实提取物、乙醇等溶剂、表面活性剂组成。制备方法将粉碎的蛇床子果实在60～70℃温度下，用甲醇回流提取，用甲醇回流提取，浓缩提取液，用无水工业酒精萃取，得浓缩萃取液。将表面活性剂、乙醇等溶剂、蛇床子果实提取物于匀质机中混合，温度控制在50℃～60℃，加工后冷却至常温，得该制剂。对寄生在水产动物体外寄生虫特别是指环虫、拟指环虫、三代虫等蠕虫具有显著的杀灭作用，无污染、不易产生抗药性、不影响水产动物进食和生长、使用剂量低、成本小、方便，替代化学杀虫剂，用于多种淡、海水鱼等水产动物寄生虫的防治。具有较好的社会和经济效益。