专利名称：G型非病毒载体以及包含其的药物组合物的制作方法 自然界存在上千种具有抗肿瘤和抗病毒活性的具有细胞毒作用的毒素蛋白，分别来自动物(如蛇毒、蜈蚣毒素、蝎毒、蚯蚓毒素等)、植物(天花粉、商陆、蓖麻等)和微生物(绿脓毒素、白喉毒素、其他病毒毒素)，尤其是海洋生物体(海棉、海葵、海星、海鞘、鲎、海藻)，蕴含着丰富的抗肿瘤抗病毒资源。但是近十多年，应用毒素抗肿瘤的研究仍然滞留在体外水平。由于毒素蛋白能够非特异性地与多种细胞结合，单独使用毒素治疗肿瘤会同时将毒素蛋白导入正常有毒素受体的细胞中，产生极强的毒副作用。为了避免毒素的毒副作用，近十年来常用的方法是将毒素蛋白与导向分子融合表达形成导向融合毒素。常用的导向分子是肿瘤细胞表面分子的抗体或其受体的配体。融合毒素通过配体-受体介导的内吞作用进入细胞发挥杀伤作用。通过这种方法获得了许多体外抗瘤作用显著的导向性融合毒素，例如TGFα-PE40，CD4(178)-PE40，IL2-PE40等。但是这些融合毒素均未能通过临床I期试验。在使用2-8周后，由于抗毒素蛋白的抗体产生，发生了免疫中和反应，使得该毒素蛋白很快失效。正因为如此使用毒素治疗肿瘤的研究一直停滞不前。另外，仅由导向分子控制的靶向性并不完全，在正常细胞表面往往也具有与肿瘤细胞表面相同的分子或受体，而且有些过量表达于肿瘤细胞表面的受体分子同时也在某些正常细胞表面过量表达，因此这种设计的导向毒素仍会导入正常细胞从而产生不可控制的毒副作用。针对应用毒素治疗肿瘤中存在的这些障碍，本领域需要在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同时，保留毒素蛋白活性从而特异性杀伤肿瘤细胞的新的靶向治疗药物及相关载体。
在第一方面，本发明提供了一种非病毒载体，其本质是一种靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受体配体多肽与富含阳性氨基酸的多肽组成。在本发明这一方面的另一个实施方案中，本发明的非病毒载体由受体配体多肽、富含阳性氨基酸的多肽及浓缩DNA的多肽组成。根据本发明，所述富含阳性氨基酸的多肽是两个串联的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的DNA结合区段或其相关片段；浓缩DNA的多肽是c-myc蛋白的DNA结合区段；所述受体配体多肽是能够与胃泌激素释放肽受体(GRP-R)特异性结合的胃泌激素释放肽(GRP)或其相关片段、类似物或突变体。由于使用GRP作为导向分子，所以本发明人将本发明的非病毒载体称为G型非病毒载体。优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核细胞或真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体(融合蛋白)。因此，在另一方面，本发明提供了编码本发明的非病毒载体的融合基因。在另一方面，本发明提供了包含本发明的非病毒载体和一种表达型DNA重组体的复合物的药物组合物，以用于靶向性恶性肿瘤的基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。根据本发明，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他一切对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物，以及人工合成的具有杀伤细胞活性的蛋白质或多肽及其相应的编码基因。优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域；更优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体。在本发明的一个优选实施方案中，所述突变体为绿脓杆菌第III功能域突变体(C段的REDLK突变成KDEL)，称为PEIIImut。它能够产生杀伤力更强的毒素蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.13所示。
本发明将毒素蛋白质靶向导入细胞的方式改为将毒素蛋白编码基因靶向导入细胞的治疗方法，在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同时，保留毒素蛋白活性从而特异性杀伤肿瘤细胞。本发明应用人源蛋白酪氨酸磷酸酶的DNA结合区段，以及c-myc蛋白的DNA结合区段和过量表达于肿瘤细胞表面、仅在有限正常细胞微量表达的受体的高亲和力配体构成融合蛋白型非病毒载体，并携带毒素基因表达型重组体DNA形成靶向性药物组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明使用的毒素基因为绿脓杆菌第III功能域突变体(C段的REDLK突变成KDEL)，称为PEIIImut。它能够产生杀伤力更强的毒素蛋白。本发明设计使PEIIImut毒素基因在组织特异性启动子癌胚抗原CEA启动子的调控下表达，从而实现PEIIImut的可控表达。所以本发明中，毒素基因PEIIImut与融合蛋白DNA结合区段结合毒素基因，在导向分子GRP的携带下，进入GRP受体表达的细胞。但是在CEA启动子的控制下毒素基因只能在GRP-R+和CEA+的肿瘤细胞内表达出PEIIImut毒素蛋白，从而杀灭该种细胞。而在GRP-R+和CEA-的正常细胞中，因PEIIImut基因无法被启动，以致没有毒素蛋白的表达，细胞将不会被杀伤。毒素基因不能被导入GRP-R-和CEA+以及GRP-R-和CEA-的非肿瘤细胞中。这样，本发明的药物组合物受导向分子和启动子”双开关”的双重调控，实现了准确的靶向杀伤作用。这一设计引导出了”个体化诊断与个体化治疗”的必要性，因此这一药物组合物的适应症只能是GRP-R++CEA+的胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌及结肠癌等肿瘤。这是本发明的一个主要特征。


图1为本发明的药物组合物的总体设计图。
图2为表达型重组体pGL3-PEIIImut及pGL3-CEA-PEIIImut的构建图谱。
图3为含有融合蛋白P2G的编码基因的重组体pET28a-P2G以及含有融合蛋白P2CG的编码基因的重组体pET28a-P2CG的构建图谱。
图4为表达型重组体pGL3-PEIIImut和表达型重组体pGL3-CEA-PEIIImut的酶切鉴定结果，其中序号1～7分别代表1HindIII分子量标记；2BamHI-XhoI双切pGL3；3KpnI-XbaI双切pGL3CEA-PEIIImut；4BamHI-HindIII双切pGL3；5HindIII-XbaI双切pGL3-PEIIImut；6CEApromoter PCR回收产物；7BstNI分子量标记。
图5为表达型重组体pET28a-P2G和pET28a-P2CG的酶切鉴定结果，其中序号1～8分别代表1λDNA/HindIII(23130bp，9416bp，6551，436Ibp，2322bp，2027bp，564bp，125bp)；2pGEX4T-1/BamHI & XhoI(4954bp)；3P2G-pGEX4T-1/BamHI & XhoI(4954bp，614bp)；4P2G-pGEX4T-1/BamHI & XhoI(4954bp，437bp)；5P2CG-pET28a/BamhI & XhoI(5328bp，615bp)；6P2G-pET28a/BamHI & XhoI(5328bp，437bp)；7pET28a/BamHI & XhoI(5328bp)；8BstNI(1857；1060；929；383；121)。
图6为表达型载体pET30a-TrxA-Th-P2G的酶切鉴定结果，其中序号1～5分别代表1TrxA的PCR产物(351bp)；2DNA分子量标记(500，400，300，200，100bp)；3TrxA-pET30a/BamHI & NdeI(351bp，5273bp)；4λDNA/HindIII & EcoRI(21226，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564，125bp)；5TrxA-Th-P2G/pET28a(828bp，5234bp)。
图7A是pET28a-P2G和pET28a-P2CG工程菌诱导后蛋白表达图谱，1未诱导的P2G/pET28a；2-4诱导的P2G/pET28a；5和8诱导的P2CG/pET28a；6未诱导的P2CG/pET28a；7蛋白质分子量标记(97.4kD，66.2kD，43kD，31kD，20.1kD，14.4kD)；9和11诱导的P2CG/pET30a；10未诱导的P2CG/pET30a。其中箭头示出表达的P2G和P2CG。图7B是pET30a-TrxA-Th-P2G工程菌诱导后蛋白表达图谱；1诱导的pET30a-TrxA-Th-P2G工程菌，2蛋白质分子量标记(97.4kD，66.2kD，43kD，31kD，20.1kD，14.4kD)，3诱导的pET30a-TrxA-Th-P2G工程菌。
图8是MKN45细胞的杀伤图。1空白；28ug/mlP2G/LIpofectamin 38ug/ml CEA-PEIIImut；48ug/ml DYPII；58ug/ml P2G/Lipofectamin/pG13；6-8 P2G/Lipofectamin/CEA-PEIIImut剂量分别为8，4，2ug/ml；9-11 P2G/Lipofectamin/DYPII剂量分别为8，4，2ug/ml。
图9是MCF-7细胞的杀伤图，1空白对照；2-4P2G/Lipofectamin/CEA-PEIIImut药物组合物剂量分别为8，4，2ug/ml；5-7P2G/Lipofectamin/DYPII剂量分别为8，4，2ug/ml。
图10是MDA-MB-231细胞的杀伤图，1空白；28ug/mlP2G/LIpofectamin 38ug/ml CEA-PEIIImut；48ug/ml DYPII；58ug/ml P2G/Lipofectamin/pG13；6-8 P2G/Lipofectamin/CEA-PEIIImut剂量为8，4，2ug/ml；9-11 P2G/Lipofectamin/DYPII剂量为8，4，2ug/ml。
图11是A549细胞的杀伤图，1空白；28ug/ml P2G/Lipofectamin38ug/ml CEA-PEIIImut；48ug/ml DYPII；58ug/mlP2G/Lipofectamin/pG13；6-8P2G/Lipofectamin/CEA-PEIIImut剂量分别为8，4，2ug/ml；9-11P2G/Lipofectamin/DYPII剂量分别为8，4，2ug/ml。
图12是Hela细胞的杀伤图，1空白；28ug/ml P2G/Lipofectamin38ug/ml CEA-PEIIImut；48ug/ml DYPII；58ug/mlP2G/Lipofectamin/pG13；6-8P2G/Lipofectamin/CEA-PEIIImut剂量分别为8，4，2ug/ml；9-11P2G/Lipofectamin/DYPII剂量分别为8，4，2ug/ml。
图13是MCF-7细胞凋亡检测图。
图14是本发明实验流程图。

本发明的总体设计及实验流程参见图1和图14所示。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种非病毒载体，其本质是一种靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受体配体多肽与富含阳性氨基酸的多肽组成。在本发明这一方面的另一个实施方案中，本发明的非病毒载体由受体配体多肽、富含阳性氨基酸的多肽及浓缩DNA的多肽组成。根据本发明，所述富含阳性氨基酸的多肽是两个串联的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的DNA结合区段或其相关片段；浓缩DNA的多肽是c-myc蛋白的DNA结合区段；所述受体配体多肽是能够与胃泌激素释放肽受体(GRP-R)特异性结合的胃泌激素释放肽(GRP)或其相关片段、类似物或突变体。由于使用GRP作为导向分子，所以本发明人将本发明的非病毒载体称为G型非病毒载体，本发明的非病毒载体对人体无免疫原性。
优选地，上述受体配体多肽GRP的编码基因是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO1；或者也可以是其野生型DNA序列，如SEQ ID NO2。
优选地，所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是两个串联的PTP蛋白的第332-388位氨基酸所代表的DNA结合区段，所述第332-388位氨基酸序列为TGLSSKMQDTMEENSESALRKRIRGDRKATTAQKVQQMKQRLNENERKRKRPRLTDT。编码该区段的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO3所示的序列；或者也可以是其野生型DNA序列，如SEQ ID NO4所示。
优选地，所述非病毒载体中的浓缩DNA的多肽是c-myc蛋白第265-318位氨基酸代表的DNA结合区段，其氨基酸序列为VSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNTAAPPSTRKD。优选地，编码该区段的DNA序列为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO5所示的序列；或者也可以是其野生型DNA序列，如SEQ ID NO6所示。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的非病毒载体从N末端至C末端由如上所述的两个串联的PTP蛋白的第332-388位氨基酸所代表的DNA结合区段和一个含27个氨基酸的胃泌激素释放肽组成，所述非病毒载体命名为P2G，其氨基酸序列如SEQ ID NO7所示，其含有33个碱性氨基酸，带24个正电荷。编码P2G的大肠杆菌嗜好型DNA序列和野生型DNA序列分别如SEQ ID NO8和SEQID NO9所示。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的非病毒载体从N末端至C末端由如上所述的两个串联的PTP蛋白的第332-388位氨基酸所代表的DNA结合区段、一个c-myc蛋白第265-318位氨基酸代表的DNA结合区段和一个人胃泌激素释放肽组成，所述非病毒载体命名为P2CG，其氨基酸序列如SEQ ID NO10所示，其含42个阳性氨基酸，带20个正电荷。编码P2CG的大肠杆菌嗜好型DNA序列和野生型DNA序列分别如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核细胞或真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体(融合蛋白)。例如在本发明的一个实施方案中，所述融合基因分别与表达型载体pET28a重组，分别命名为pET28a-P2G和pET28a-P2CG；另外P2G融合基因也可以与pET30a-TrxA表达载体重组获得重组子pET30a-TrxA-Th-P2G。用上述质粒分别转化大肠杆菌DH5α，获得可以表达融合蛋白的工程菌。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的非病毒载体和一种表达型DNA重组体的复合物的药物组合物，以用于靶向性恶性肿瘤的基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域；更优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体。
绿脓杆菌毒素(PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素，其是一种极毒的毒素，仅仅对小鼠一次静脉注射0.3微克即可使之在24小时内死亡。对一个细胞来说几个分子的毒素的导入即可使这个细胞死亡。由于PE这种独特的性能，使其作为一种很有前途的毒素被应用到肿瘤的基因治疗中去。PE具有三个结构域，结构域Ia(AA1-252)为细胞结合结构域，结构域III(AA405-613)为ADP糖基化区域，结构域II和结构域III又合称为PE40，而结构域Ib(AA365-404)无明显的生物学功能。
本发明使用的是毒素基因PEIIImut表达重组体。优选地，所述表达型重组体为基于pGL3(Promega)而构建的表达型重组体pGL3-PEIIImut；或者是受CEA启动子控制的真核重组表达型重组体pGL3-CEA-PEIIImut；或者是受CEA启动子与兔珠蛋白第二内含子控制的真核重组表达型重组体pGL3-CEA-IntronII-PEIIImut。
所述的表达型重组体与本发明的非病毒载体的DNA结合组分结合，并在导向分子GRP的作用下被特异性导入GRP受体(GRP-R)表达的细胞中，在该种细胞中进行表达，杀伤该种肿瘤细胞。为了避免毒素基因被导入正常表达GRP-R的细胞中，从而表达出毒素蛋白质而杀伤正常细胞，导致毒副作用，如上所述将毒素基因PEIIImut连接在组织特异性启动子CEA启动子(癌胚抗原基因启动子)的下游，调控其表达。因为只有在CEA表达的肿瘤细胞内才存在某些特定的反式调控元件，能够与CEA启动子中的顺式元件相互作用，启动子被激活，进而启动PEIIImut毒素基因的表达。而在CEA不表达的细胞中由于缺乏激活启动子所必需的反式因子，即使pGL3-CEA-PEIIImut重组体被导入正常细胞，却因启动子不能启动下游基因的表达，正常细胞也不会被杀伤。GRP-R与CEA是否表达可以通过反式PCR进行检测；在有些肿瘤中，CEA会出现在血液中，所以也可以采用临床肿瘤诊断中的常用方法检测CEA的表达。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，提供了CEA启动子调控下的PEIIImut表达型重组体，该重组体中的CEA启动子序列如SEQ ID NO.14所示。根据本领域公知的技术可以将CEA启动子序列和PEIIImut编码序列插入常用真核表达载体pGL3中获得一种PEIIImut表达重组体pGL3-CEA-PEIIImut。所述表达重组体用于转化合适的宿主细胞如大肠杆菌DH5α而保持。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供了用于恶性肿瘤靶向基因治疗的药物组合物，其包含上述表达型重组体与非病毒载体的复合物。在本发明的这种用于靶向性基因治疗的药物的应用中，包含PEIIImut的表达型重组体与本发明非病毒载体中可结合DNA的组分，即人PTP DNA结合区或PTP DNA结合区与c-myc DNA结合区的融合序列紧密结合，融合蛋白中的导向组分GRP通过与恶性肿瘤细胞(包括MKN45细胞、MCF-7细胞等)表面的GRP-R结合而将复合物导入细胞内，在该细胞中PEIIImut表达型重组体表达毒素蛋白，从而将细胞杀死。
具体地说，由于本发明的药物组合物是将毒素基因导入GRP-R表达的恶性肿瘤细胞，在能够表达CEA的细胞中表达，因此，就不需要毒素的跨膜转运结构域。正是由于这种原因，本发明的毒素基因PEIIImut中仅含有绿脓杆菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III结构域的编码序列。该编码序列在靶细胞中表达出的蛋白可作为杀死靶细胞的毒素。另外，本发明人用白喉毒素C端的4个氨基酸残基KDEL替代了PE毒素C端的5个氨基酸残基REDLK，由此大大增强了毒素的杀死细胞能力。另外，由于毒素蛋白是在细胞内进行表达，这就彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。而且由于CEA与GRP-R的双开关设计，避免了毒素蛋白对正常表达GRP-R的细胞的毒副作用。
本发明的药物组合物中应用与GRP-R有高亲和力的配体GRP为导向分子，出于高表达水平的需要，基于细菌在表达蛋白时对遗传密码子的偏爱性的考虑，在构建表达型重组体时，将其与PTP DNA结合区段、c-myc DNA结合区段中天然存在的密码子突变为最适或较适的密码子。采用分次PCR和长引物PCR拼接技术，获得了所需目的基因片段。为了便于融合蛋白中的导向部分和DNA结合部分之间的重组操作，在具体实施过程中在P2G中，两个PTP DNA结合区段通过DraI酶切相连；P2CG中两个PTP DNA结合区段通过DraI酶切相连、与c-myc DNA结合区段通过EcoRI相连、与GRP通过NdeI连接。
本发明的非病毒载体利用人体内正常存在的DNA结合蛋白分子中的一部分作为结合DNA的功能区。所采用的PTP片段经串联后含有32个阳性氨基酸，该多肽片段在一定pH条件下带正电荷，能通过静电作用与带负电荷的DNA结合。C-myc蛋白的DNA结合区段不带正电荷，通过特定的序列特征与DNA结合，具有浓缩DNA的作用。这样设计的两种融合蛋白既可以结合并包裹DNA分子同时保证了融合蛋白的低免疫原性及复合药物且可被靶细胞内吞。
以下通过实施例进一步描述本发明。
实施例1 PEIIImut表达型重组体的构建1、表达型重组体的构建设计CEA启动子(Pcea)特异性PCR扩增引物，从基因组DNA中扩增出204bp的启动子序列。引物序列如下上游(31bps)5′cg ctc gag tgg aga gca tgg gga gac ccg gg 3′下游(30bps)5′cg cca tgg gtc tct gct gtc tgc tct gtc c 3′PCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒。经35个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的目的片段大小正确，切胶回收小片段，用玻璃奶纯化试剂盒纯化回收片段(下文同)。取少量回收片段，并在体系中加入dNTP，Taq酶，10X Taq缓冲液，70℃反应30min，利用Taq酶在PCR产物末端加A的特性进行加A反应后，将目的片段克隆到T载体上。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符。用XhoI和HindIII双切鉴定，阳性转化子T-Pcea应切出216bp的小片段和3kb大片段。回收小片段。用相同的酶处理pGL3-promoter，得到4791bp的大片段和219bp小片段回收载体大片段。将Pcea克隆到载体大片段中。XhoI和HindIII双切将定转化子，阳性转化子pGL3-Pcea应切出216bp的小片段和4791bp的大片段。
用EcoRI和EcoRv双切重组子pA-PEIIImut，回收649bp的目的片段PEIIImut。用相同的酶双切载体pBSKS，回收载体大片段。将PEIIImut克隆到该载体上。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克等主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符挑取白斑的转化子酶切鉴定，可以切除649bp的目的片段的为阳性转化子pBSKS-PEIIImut。用XbaI和HindIII从pBSKS-PEIIImut上双切下675bp PEIIImut片段，将其克隆到pGL3-Pcea相同的酶切位点上。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符。用KpnI和XbaI双切鉴定应得到924bp和3081bp的片段。阳性重组子命名为pGL3-Pcea-PEIIImut。用XbaI和HindIII双切处理载体pGL3，将PEIIImut插入其中。用同样的酶双切鉴定应得到3321bp和687bp的片段。阳性重组子命名为pGL3-PEIIImut。构建过程及酶切鉴定图谱如图2和4。
实施例2 编码GRP的突变基因的获得胃泌激素释放肽(gastrin releasing peptide，GRP)由27个氨基酸组成。其1-23位氨基酸的编码序列位于胃泌激素释放肽基因的第一外显子内，而剩余4个氨基酸位于第二外显子内。根据此序列特征并兼顾大肠杆菌表达系统密码子嗜好性设计出内外两对上、下游引物，可以从基因组DNA中PCR扩增出目的GRP编码序列(包括终止密码子及酶切位点共长99bp)。上游内引物包括3-12位氨基酸的编码序列，同时将第7、8位Gly原有密码子GGA改为大肠杆菌嗜好的GGT。上游外引物中引入NdeI限制性内切酶识别位点，含有1、2位氨基酸的编码区及与上游内引物相同的20个核苷酸。下游内引物与15-23位氨基酸的编码区段互补，并将24位氨基酸Gly原有的密码子GGG改为大肠杆菌嗜好的GGT，还包括25位氨基酸密码子的互补序列。下游外引物与下游内引物有21个核苷酸完全相同，同时将26位氨基酸Leu原有的密码子TTA改为大肠杆菌嗜好的CTG，并引入两个串联的终止密码子(TGA TAA)和XhoI限制性内切酶识别位点。PCR扩增分两步进行，第一步以基因组DNA为模板用上下游内引物扩增出长63bp的目的片段，切胶回收纯化此片段；第二步以纯化的PCR片段为模板用上下游外引物进行PCR反应，扩增出含NdeI和BamHI酶切位点和两个终止密码子的目的片段。最终的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，切胶回收。用EcoRV酶切过渡载体pBS-KS，切胶回收线性化载体片段，与回收的GRP目的片段连接。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁 等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，限制性分析证实质粒插入片段大小与目的基因相符。阳性克隆命名为得到克隆pBS-KS-GRP。测序结果显示除修改的密码子外插入片段与GenBank提供的GRP编码序列一致。
使用的引物如下内引物上游(33bps)5′ctg cct gcg ggc ggt ggt acc gtg ctg acc aag 3′下游(36bps)5′gtg acc cac cgc cca gtg gtt gcc gcg cgg gta cat 3′外引物上游(32bps)5′ gtc ccg ctg cct gcg ggc ggt ggt ac3′NdeI下游(39bps)5′ tta tca cat cag gtg acc cac cgc cca gtg gtt 3′XhoI内引物扩增的过程为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸30秒。经35个循环后，72℃延伸10分钟。外引物扩增的条件是94℃变性3分钟后开始循环94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸30秒。经35个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。
具体地，GRP原来的野生型序列如SEQ ID NO2所示，经突变后的GRP的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3 编码PTP DNA结合区的突变基因的获得为了获得大肠杆菌嗜好性密码子组成的编码序列，PTP DNA结合区段(PTPc)是通过搭桥PCR的方法获得的。PTPc全长171bp(不含酶切位点)，因此共合成4条(两对)大引物(长度为60bp左右)进行PCR拼接，另合成两对小引物(含不同的酶切位点，长20bp左右)在目的片段的大量扩增中使用。相邻的大引物间有20-25bp的重叠。小引物分别和上、下游引物的5’端配对。大引物序列如下，黑体部分为重叠区
上游(59bps)5’aca ggt ctt tcc tct aaa atg caa gat aca atggag gag aac agt gag agt gct cta cg 3’(P1)上游中端(60bps)5’agc tgt ggt ggc ctt tct gtc ctc tcg aat acgttt gcg cag agc act ctc act gtt ctc 3’(P2)下游中端(60bps)5’gag gac aga aag gcc acc aca gct cagaag gtg cag cag atg aaa cag cgt ctg aat gag 3’(P3)下游(60bps)5’ggt gtc agt cag gcg tgg acg ttt tct ttt acgttc att ctc att cag acg ctg ttt cat 3’(P4)拼接过程包括三个PCR反应。第一个反应中P1与P2既是引物又互为模板，PCR扩增得到96bp的片段(P12)，切胶回收该片段。第二个反应中P3与P4既是引物又互为模板，可以得到99bp的片段(P34)，切胶回收该片段。第三个PCR反应中，取少量P12和P34进行拼接，两者既是引物又互为模板及进行扩增，可以得到长171bp的目的片段PTPc。PCR反应过程为94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸30秒。经35个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。
具体地，PTP DNA结合区天然序列如SEQ ID NO4所示，经突变后的PTPDNA结合区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。PTP的DNA结合区的氨基酸序列为TGLSSKMQDTMEENSESALRKRIRGDRKATTAQKVQQMKQRLNENERKRKRPRLTDT。
为了便于两个PTP序列以及与c-myc的衔接，分别在上游PTP的5’端引入BamHI位点，3’端引入DraI位点；下游PTP 5’端引入DraI位点，3’端引入EcoRI位点。
实施例4 编码c-myc DNA结合区的突变基因的获得c-myc DNA结合区(c-mycδ)中存在数个大肠杆菌利用率极低的密码子，为了避免其对蛋白表达水平的影响，本试验拟通过搭桥PCR的方法拼接出大肠杆菌嗜好性的编码区段。编码区段长162bp，需要合成三条大引物进行拼接。每条引物中的密码子根据大肠杆菌密码子嗜好性表显示的利用率进行选择，将原始序列中的大肠杆菌不嗜好密码子优选换成利用率高的密码子。每条引物间有20-25bp的碱基重叠，序列如下(黑体代表重叠区)上游(60bps)5’gtt tct gtg gaa aag cgc cag gct cct ggc aaa cgc tct gag tct ggctcc cct tct gct 3’(P1)下游1(60bps)5’gac cag tgg gct gtg agg agg ttt gct gtg gcc acc agc aga agggga gcc aga ctc aga 3’(P2)下游2(90bps)5’gtc ctt gcg agt gga cgg agg cgc tgc gta gtt gtg ctg atgggt gga cac gtg gca gcg ctt gag gac cag tgg gct gtg agg agg ttt 3’(P3)整个拼接的过程包括两次PCR反应。首先使P1引物与P2引物进行拼接，即在PCR反应体系中二者既是引物又互为模板。第一个PCR反应可以得到长96bp的PCR产物(P12)，切胶回收所得片段，并取少量P12作为第二个PCR反应的模板。P12在第二个反应体系中与P3互为模板，进行第二次拼接。反应体系与第一个PCR反应相似，只需用P12替代P1；反应过程完全相同。经过两次PCR拼接即可以获得长162bp的目的片段。本试验同时合成了一对小引物用于扩增拼接出的目的片段，序列如下。为了便于将C-mycδ接入融合蛋白的编码序列中，在5’和3’小引物的5’端分别引入限制性酶切位点EcoRI和NdeI(见划线序列)5’端引物(27bps)5’gaa ttcgtt tct gtg gaa aag cgc cag 3’EcoRI3’端引物(27bps)5’cat atggtc ctt gcg agt gga cgg agg 3’NdeI最终获得的PCR产物为长174bp，含有EcoRI和NdeI酶切位点的大肠杆菌嗜好性C-mycδ编码序列。拼接PCR过程为94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸30秒。经35个循环后，72℃延伸10分钟。小引物扩增过程是94℃变性3min。94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸30秒，35个循环后，72℃延伸10分钟。使用的扩增酶为Promega公司(麦迪逊，威斯康星，美国)的高保真Pfu。
c-myc DNA结合区的原始编码序列SEQ ID NO6所示，大肠杆菌嗜好型序列如SEQ ID NO5所示。
实施例5 pET28a-P2G、pET28a-P2CG重组体的构建5.1 pGEX4T-1-P2G与pGEX4T-1-P2CG的构建用相应的限制性内切酶将GRP、PTPc各种片段和C-myc DNA结合区编码序列从过渡载体上切下来，并切胶回收。用EcoRI和XhoI双切载体pGEX-4T-1并回收载体大片段。同时将末端互补的片段GRP和C-mycδ与处理好的载体pGEX-4T-1进行连接。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。挑取转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，用EcoRI和XhoI双切鉴定挑选的转化子，阳性转化子应切出大小为267bp的小片段和4963bp的大片段。选取阳性转化子pGEX4T-1-CG进行下一步克隆。用BamHI和EcoRI双切pGEX4T-1-CG并回收大片段。同时将BamHI-PTPc-DraI与DraI-PTPc-EcoRI与处理好的pGEX4T-1-CG进行连接。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。挑取转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，用BamHI和XhoI双切鉴定挑取的转化子，阳性转化子应切出大小为614bp的小片段，4954bp的大片段。P2CG融合蛋白编码序列的克隆采用两个小片段同时克隆到载体上的方法，使用的连接体系中两个小片段的比例为1∶1，两个小片段的加和与载体大片段的比例为1∶1-1∶3，连接体系一般为20μl，连接酶用量为1-2U，16℃连接过夜。
P2G融合蛋白的编码序列是在P2CG序列的基础上通过EcoRI和NdeI切割、再补平的方法获得的。EcoRI和NdeI切割后均形成3’凹端，用Klenow大片段补平后连接不会造成密码子移位，所以不改变氨基酸序列。转化子用BamHI和XhoI双切鉴定，阳性转化子应切出437bp的小片段，和4954bp的大片段。测序结果显示克隆的P2G和P2CG编码序列完全正确。
P2G融合蛋白的序列见SEQ ID NO.7；P2CG融合蛋白的序列见SEQ ID NO.10；编码基因的测序结果分别见SEQ ID NO.8和11。
5.2 pET28a-P2G与pET28a-P2CG重组子的构建用BamHI和XhoI双切pGEX4T-1-P2CG，切胶回收P2CG小片段。用相同的酶双切载体pET28a(5369bp)，切胶回收大片段，将两个片段进行连接。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，用BamHI和XhoI双切鉴定转化子，阳性转化子pET28a-P2CG应切出615bp的小片段和5328bp的大片段。用BamHI和XhoI双切pGEX4T-1-P2G，切胶回收P2G小片段。用相同的酶双切载体pET28a(5369bp)，切胶回收大片段，将两个片段进行连接。用BamHI和XhoI双切鉴定转化子，阳性转化子pET28a-P2G应切出456bp的小片段和5328bp的大片段。将阳性转化子pET28a-P2G和pET28a-P2CG转化BL21(DE3)细菌感受态，获得表达工程菌。P2G融合蛋白的序列如SEQ ID NO.7所示；P2CG融合蛋白的序列如SEQ ID NO.10所示；编码基因的测序结果分别见SEQ ID NO.8和11。
实施例6 pET30a-TrxA-Th-P2G的构建6.1 PCR获得TrxA编码序列以pET32a为模板扩增硫氧还蛋白编码序列，在序列的上下游分别引入酶切位点NdeI和BamHI。同时在TrxA序列末端引入Gly-Ser-Gly-Ser-Gly接头的编码序列，此5个氨基酸可形成一种柔性接头，利于下文提及的Thrombin识别位点的暴露。所用引物如下TrxA5’引物CG CAT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CACTrxA3’引物；CG GGA TCC GCC AGA ACC AGA ACC GGC CAGPCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性30秒，53℃退火40秒，72℃延伸40秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶高保真Pfu。
扩增出的目的片段大小为351bp。回收电泳鉴定大小正确的片段，将其插入EcoRv线性化的过渡载体pBSKS上。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，用NdeI和BamHI双切鉴定，回收阳性转化子pBSKS-TrxA切下的小片段。阳性转化子经测序鉴定PCR扩增的TrxA序列与pET32a载体提供的序列一致。用NdeI和BamHI双切载体pET30a，回收载体大片段，将TrxA插入其中。用NdeI和BamHI双切鉴定转化子，阳性转化子pET30a-TrxA应切出351bp的小片段和5273bp的大片段。TrxA的氨基酸序列为
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGGS。
经测序显示TrxA的DNA编码序列如SEQ ID NO.15所示。
6.2 pET30a-TrxA-Th-P2G重组体的构建为了便于目的蛋白与TrxA的分离，重新合成引物，在5’端引物上游引入BamHI位点和7个氨基酸的凝血酶识别位点。以pGEX4T-1-P2CG为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃变性3分钟后开始循环94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸40秒。经35个循环后，72℃延伸5分钟。使用的扩增酶高保真Pfu。使用引物为上游(49bp)5’ggatccggcgttcgtggtccgcgttctacaggtctttcctctaaaat gc 3’下游(39bps)5′ctc gag tta tca cat cag gtg acc cac cgc cca gtg gtt 3′电泳鉴定PCR扩增的片段，正确大小是477bp。切胶回收目的片段，加A后与T-载体相连。连接子转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，利用蓝白板筛选阳性克隆。挑取白斑转化子按照《分子克隆实验指南》(第二版)(J.萨姆布鲁克，等.主编，金冬雁等译，科学出版社，1992)的碱裂解法小量制备抗性克隆的质粒DNA，用BamHI和XhoI双切鉴定，应切出477bp的小片段。用BamHI和XhoI双切阳性转化子T-Th-P2G，回收目的小片段。将小片段插入pET28a中，再用BamHI和XhoI双切鉴定，阳性转化子应切出477bp的小片段和5328bp的大片段。将阳性转化子转化BL21(DE3)细菌感受态细胞，获得表达工程菌。经测序显示含有凝血酶识别位点的P2G序列如SEQ ID NO.16所示。
实施例7 融合蛋白P2G和P2CG在大肠杆菌中的表达
1.目的蛋白的表达与鉴定将工程菌分别接种于5ml LB培养基，同时加入终浓度为50mg/ml的卡那霉素，37℃振摇培养过夜。次日按1％接种量分别接种于两管5ml LB/Kan+培养液。在37℃下振摇培养至OD600约为0.4-0.6。各取一管加入终浓度为0.6mM的IPTG(Takara公司产品)，与另一管继续在37℃振荡培养3-4h；未加IPTG的作为未诱导对照。4000g离心收集菌体，加入上样缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，100mmol/L DTT，2％ SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，混匀，置于100℃沸水浴保持5min。10000g离心1min，取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白质表达量通过Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处扫描，并计算表达量。详细方法参见参见卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》第二版，365-387页。
2.结果经SDS-PAGE分析显示，pET28a-P2CG工程菌所表达的目的蛋白在约30kD处有明显的蛋白带出现，比理论氨基酸序列推算的分子量略大。而对照空载体、含有重组子但未诱导的在相应位置上均没有该条带，初步断定为所要的目的蛋白。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白占细胞总蛋白的23％。用同样的方法，对工程菌pET28a-P2G和pET30a-TrxA-Th-P2G所表达蛋白进行SDS-PAGE分析显示，分别在约20KD和31KD处有蛋白带出现，但均比理论推算分子量大，而空载体相应位置上没有明显带出现。经SDS-PAGE凝胶激光扫描分析，目的蛋白分别均占细胞总蛋白的18％。
实施例8 融合蛋白的大量制备与纯化1.大体积培养工程菌pET28a-P2G、pET28a-P2CG和pET28a-TrxA-Th-P2G分别种接种于50ml LB培养基，同时加入终浓度为50mg/ml的卡那霉素，37℃振摇培养过夜。按1％接种量重新接种于含有500ml LB/Kan+培养液的2L三角瓶中。在37℃下振摇培养至OD600约为0.4-0.6。然后加入终浓度0.6mM的IPTG开始诱导，培养物继续在37℃振摇培养诱导3-4h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。
取少量冻存菌体重悬于pH8.0 20mM Tris-HCL缓冲液中，在冰上超生菌体，超声频率不宜大，每10sec间歇一次，共超三次。12000g离心10min，取上清、沉淀行SDS-PAGE电泳鉴定。发现pET28a-P2G和pET28a-P2CG均为包涵体表达；而pET30a-TrxA-Th-P2G为上清表达。
2.包含体的制备2.1 洗涤细胞6000g×15分钟离心收集细菌，称重湿菌体。用3％Triton X-100洗涤菌体，搅拌器上搅匀30分钟，6000g×15分钟离心收集用量为10ml-50ml缓冲液/1g湿菌体(包括下列各种洗涤缓冲液)。
2.2 破细胞用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制50mmol/LTris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％ Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
2.3 超声处理每次超打10秒，间隔15秒，20-50次作用(视菌体浓度而定)，至菌体不再粘稠为止。然后离心收集，6000g×15分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
2.4 5％Triton X-100洗涤用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理30次，参见上述步骤2.3。缓冲液为50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％TritonX-100。离心收集沉淀，6000g×15分钟。
2.5 包含体的保存与溶解2.5.1 用少量8M尿素逐渐溶解包含体，取20μl溶液加入2X上样缓冲液，混匀，沸水中煮3-5分钟。取20ul进行SDS-PAGE电泳分析。其余包含体可冻存于-70℃。
2.5.2 如果过柱纯化，应按下述步骤操作用含体溶解液(50mmol/LTris.Cl，pH8.0，2mmol/L EDTA，10mMDTT，7M盐酸胍)溶解包含体，包含体浓度约为10mg/ml。将溶解的包含体12000g离心后，取上清，得到可以上柱的样品溶液。
2.5.3 上清蛋白的制备再冻存菌体中加入1/20体积的缓冲液50mM Tris-HCl、10mMEDTA、100mM NaCl，pH8.5，重悬菌体。菌体完全混匀后，置于冰上进行超声破菌，方法同上。菌液清亮后，于12000g，4℃离心15分钟。收集上清液，于4℃对阳离子柱起始缓冲液(0.03M Na2HPO3，pH6.5)透析，以备下一步过柱纯化。
3.目的蛋白的纯化3.1 包涵体蛋白的切胶纯化取2.3步骤中所制备的包含体溶液，加入等体积2x上样缓冲液中，进行15％的SDS-PAGE电泳。
a.凝胶切割切下蛋白Marker泳道所在的胶条和少部分样品胶条，将其放入快速染色液中速染15分钟，剩余凝胶用保鲜膜包好置于4℃冰箱。速染的胶条脱色显出条带后，将胶条与剩余的凝胶对比，切下含目的带部分的凝胶条。
b.电洗脱将切下的凝胶条装入透析袋中并置于水平电泳槽中，加入蛋白电泳缓冲液进行电泳。电泳2～4h后反向电泳5分钟。将透析袋中的缓冲液倒入50ml离心管中，并转入另一透析袋对去离子水透析1天。透析后的溶液转入另一灭菌的干净50ml离心管中c.痕量SDS的去除在离心管中加入5倍体积以上的冰冻酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，-20℃沉淀过夜。10,000r/m离心10分钟，去掉上清收集沉淀。将收集的沉淀用蛋白沉淀液洗涤1次。
d.蛋白沉淀的保存用氮气吹干蛋白沉淀。沉淀干粉置-20℃冰箱可保存1个月。
3.2 上清蛋白的层析纯化3.2.1 SP Sepherose阳离子交换柱将透析好的上清蛋白样品过0.22μm滤膜后，用阳离子交换柱(HitrapTM1ml SP SepheroseTMFF，Pharmacia)进行第一步纯化。先用起始缓冲液(0.03M Na2HPO3，pH6.5)平衡柱子5-10个柱体积，然后上样。每次上样35ml。洗脱前仍用起始缓冲液洗柱子(2-5个柱体积)洗柱子。升梯度0-25％、2540％、40-100％进行洗脱，每个梯度下洗脱3-5min。洗脱缓冲液为0.03M Na2HPO3/1M NaCl。个洗脱峰经SDS-PAGE电泳鉴定。目的蛋白在第二个洗脱梯度25-40％，电导为29.4-43％ms/cm完全洗脱。
3.2.2 凝血酶的切割将第一步纯化产物对pH8.0，50mM Tris-HCl，75mM NaCl缓冲液透析至盐离子浓度与pH和缓冲液相同。在蛋白样品中按1mg蛋白加入2U凝血酶的比例，加入适量凝血酶，28℃切割2-4hr。切割体系立即进入第二步纯化。
3.2.3 Resource S阳离子交换柱将凝血酶(thrombin)切割后的蛋白混合物过0.22μm滤膜后，加入pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释一倍以上，即可过ResouceTMS阳离子交换柱进行纯化(Pharmacia)。柱子用同一缓冲液平衡5个柱体积以上，即可上样。洗脱缓冲液是50mM Tris-HCl/1MNaCl。升梯度0-40％-100％进行洗脱。目的P2G蛋白在40-100％的梯度下被洗脱。
3.2.4 反相柱用反相柱A缓冲液(10％乙腈，0.05％三氟乙酸)将第二柱的目的洗脱峰稀释一倍以上，并用A液平衡柱子5个柱体积后，即可上样。柱子(source 15，自装)经A缓冲液平衡。洗脱缓冲液为90％乙腈、0.1％三氟乙酸。升梯度0-40％、40-100％进行洗脱。电泳鉴定各洗脱峰。目的蛋白在第二个洗脱峰洗脱。冻干目的蛋白除去乙腈与三氟乙酸。蛋白干粉冻存于-80℃待用。
实施例9 靶向基因药物P2G或P2CG与pGL3-PEIIImut或pGL3-CEA-PEIIImut或DYPII的复合物的制备及其对肿瘤细胞的杀伤作用1 复合药物的制备将冻存的目的蛋白溶于2M NaCl溶液，4℃对生理盐水透析，至盐离子浓度平衡。使用Pierce公司的BCA试剂盒测定蛋白含量。等体积加入适量各种毒素基因表达重组体，于室温反应15-30min，使复合药物形成。在琼脂糖凝胶电泳中会出现复合物中的DNA滞留于加样孔中的情况。其中DNA与P2CG的质量比是1∶4；与切胶回收的P2G的比例是1∶3；与层析纯化的P2G的比例是1∶5。
为了加强蛋白与DNA复合药物的的紧密度，在1∶5的DNA/P2G体系中加入质量为DNA 1/2的Lipofectamin(Gibcal)。
转染细胞前各种复合药物用不含血清的细胞培养基稀释，过0.22μm滤膜除菌。
2 复合药物的杀伤实验选用GRP-R+与CEA+的胃癌细胞株MKN45，乳腺癌MCF-7，GRP-R+与CEA-的乳腺癌细胞株MDA-MB-231，选用GRP-R-与CEA+的肺癌细胞株A549，以及GRP-R-与CEA-的宫颈癌细胞株Hela进行转染实验。MKN45，MCF-7，A549和Hela使用含10％胎牛血清的DMEM培养基，MDA-MB-231细胞株使用含10％胎牛血清的L15培养基，在37℃，CO2分压5％的孵箱中培养。血清均为四季青公司的产品，培养基为Gibcal公司产品。转染前将各种细胞以104的浓度接种于96孔板(Costar，丹麦哥本哈根)中，培养至80％汇合度。弃去旧培养基，并用相应的不含血清的培养基洗细胞2遍，加入各种复合药物，以及单独DNA，单独蛋白，蛋白与pGL3空载体形成的复合物，进行靶向杀上试验。含有毒素基因的复合药物有切胶回收P2G分别与pGL3-PEIIImut、pGL3-CEA-PEIIImut形成的复合药物；P2CG分别与这两种重组体形成的复合药物，这四种复合物的试验剂量分别是0.5、1、4μg/ml；过柱纯化P2G分别与pGL3-CEA-PEIIImut、DYPII及适量Lipofectamin形成复合药物，使用剂量分别是2、4、8μg/ml。各种对照组使用的是与复合药物剂量相对应的最高剂量。
转染6-10hr后，弃去含各种药物的培养液，用不含血清的培养基洗细胞两边，加入含10％胎牛血清的培养基继续培养24-32hr。MTT法检测活细胞数，T检验分析显示高剂量的复合药物对GRP-R+与CEA+的胃癌细胞株MKN45，乳腺癌MCF-7细胞有强烈的杀伤区作用(P＜0.05)，而对其余3种细胞没有杀伤作用(P＞0.05)；各种对照组也没有杀伤作用(P＞0.05)。结果如表1，2-6所示。
当复合药物使用剂量为1ug/ml和4ug/ml时，P2G/pGL3-CEA-PEIIImut复合药物对MKN45细胞的的杀伤率是20.2％和29.8％；P2CG/pGL3-CEA-PEIIImut对MKN45的杀伤率为14.1％和26.2％；P2G/pGL3-PEIIImut对MKN45的杀伤率分别是28.4％和50.5％；P2CG/pGL3-PEIIImut为27.1％和45.3％。P2G复合物与P2CG复合物杀伤率之间无显著性差异。在0.5ug/ml时4种复合药物均无杀伤。
当复合药物使用剂量分别是2ug/ml、4ug/ml和8ug/ml时，两种复合药物P2G/Lipofectamin/pGL3-Pcea-PEIIImut和P2G/Lipofectamin/DYPII对MKN45的杀伤率分别是27.9％、39.4％、48.4％和30.4％、38％、44.4％；对MCF-7的杀伤率是21.1％、35.8％、44.1％和23.5％、34.9％、43.7％。各种剂量的复合药物均对MDA-MB-231，A549和Hela细胞无杀伤作用(P＞0.05)。药物组合物对MCF-7和MKN45细胞的杀伤作用是由于毒素蛋白在胞内表达引发细胞凋亡所致，凋亡如图13。
表1 P2G、P2CG及重组质粒、蛋白/DNA复合物的杀伤细胞试验


剂量是指复合物中DNA的浓度。
表2 P2G、重组质粒及复合物转染MKN45的细胞杀伤试验

剂量是指复合物中蛋白、DNA、Lipofectamin的浓度，对应顺序如组别(group)中所述。
表3 P2G、重组质粒及复合物转染MCF7的细胞杀伤试验

剂量是指复合物中蛋白、DNA、Lipofectamin的浓度，对应顺序如组别中所述。
表4 P2G、重组质粒及复合物转染MDA-MB-231的细胞杀伤试验

剂量是指复合物中蛋白、DNA、Lipofectamin的浓度，对应顺序如组别中所述。
表5 P2G、重组质粒及复合物转染A549的细胞杀伤试验

剂量是指复合物中蛋白、DNA、Lipofectamin的浓度，对应顺序如组别中所述。
表6 P2G、重组质粒及复合物转染Hela的细胞杀伤试验

剂量是指复合物中蛋白、DNA、Lipofectamin的浓度，对应顺序如组别中所述。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>G型非病毒载体以及包含其的药物组合物<130>I20031303CB<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>99<212>DNA<213>人工序列<400>1catatggtcc cgctgcctgc gggcggtggt accgtgctga ccaagatgta cccgcgcggc60aaccactggg cggtgggtca cctgatgtga taactcgag 99<210>2<211>81<212>DNA<213>人<400>2gtcccgctgc ctgcgggcgg agggaccgtg ctgaccaaga tgtacccgcg cggcaaccac60tgggcggtgg ggcacttaat g 81<210>3<211>171<212>DNA<213>人工序列<400>3acaggtcttt cctctaaaat gcaagataca atggaggaga acagtgagag tgctctgcgc 60aaacgtattc gagaggacag aaaggccacc acagctcaga aggtgcagca gatgaaacag120cgtctgaatg agaatgaacg taaaagaaaa cgtccacgcc tgactgacac c 171<210>4<211>170<212>DNA<213>人<400>4acaggatttc ctctaaaatg caagatacaa tggaggagaa cagtgagagt gctctacgga 60aacgtattcg agaggacaga aaggccacca cagctcagaa ggtgcagcag atgaaacaga120ggctaaatga gaatgaacga aaaagaaaaa ggccacgcct gactgacacc 170<210>5
<211>174<212>DNA<213>人工序列<400>5gaattcgttt ctgtggaaaa gcgccaggct cctggcaaac gctctgagtc tggctcccct 60tctgctggtg gccacagcaa acctcctcac agcccactgg tcctcaagcg ctgccacgtc120tccacacatc agcacaacta cgcagcgcct ccgtccactc gcaaggacca tatg 174<210>6<211>161<212>DNA<213>人<400>6gtttctgtgg aaaagaggca ggctcctggc aaaaggtcag agtctggatc accttctgct 60ggaggccaca gcaaacctcc tcacagccca ctggtcctca agaggtgcca cgtctccaca120catcagcaca actacgcagc gcctcctcca ctggcaagga c161<210>7<211>148<212>PRT<213>人工序列<400>7Arg Ser Thr Gly Leu Ser Ser Lys Met Gln Asp Thr Met Glu Glu Asn1 5 10 15Ser Glu Ser Ala Leu Arg Lys Arg Ile Arg Glu Asp Arg Lys Ala Thr20 25 30Thr Ala Gln Lys Val Gln Gln Met Lys Gln Arg Leu Asn Glu Asn Glu35 40 45Arg Lys Arg Lys Arg Pro Arg Leu Thr Asp Thr Phe Lys Thr Gly Leu50 55 60Ser Ser Lys Met Gln Asp Thr Met Glu Glu Asn Ser Glu Ser Ala Leu65 70 75 80Arg Lys Arg Ile Arg Glu Asp Arg Lys Ala Thr Thr Ala Gln Lys Val85 90 95Gln Gln Met Lys Gln Arg Leu Asn Glu Asn Glu Arg Lys Arg Lys Arg100 105 110Pro Arg Leu Thr Asp Thr Glu Phe Met Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly
115 120 125Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His Trp Ala Val130 135 140Gly His Leu Met145<210>8<211>456<212>DNA<213>人工序列<400>8ggatccacag gtctttcctc taaaatgcaa gatacaatgg aggagaacag tgagagtgct 60ctgcgcaaac gtattcgaga ggacagaaag gccaccacag ctcagaaggt gcagcagatg120aaacagcgtc tgaatgagaa tgaacgtaaa agaaaacgtc cacgcctgac tgacaccttt180aaaacaggtc tttcctctaa aatgcaagat acaatggagg agaacagtga gagtgctctg240cgcaaacgta ttcgagagga cagaaaggcc accacagctc agaaggtgca gcagatgaaa300cagcgtctga atgagaatga acgtaaaaga aaacgtccac gcctgactga caccgaattt360atggtcccgc tgcctgcggg cggtggtacc gtgctgacca agatgtaccc gcgcggcaac420cactgggcgg tgggtcacct gatgtgataa ggatcc 456<210>9<211>438<212>DNA<213>人工序列<400>9acaggtcttt cctctaaaat gcaagataca atggaggaga acagtgagag tgctctgcgc 60aaacgtattc gagaggacag aaaggccacc acagctcaga aggtgcagca gatgaaacag120cgtctgaatg agaatgaacg taaaagaaaa cgtccacgcc tgactgacac ctttaaaaca180ggtctttcct ctaaaatgca agatacaatg gaggagaaca gtgagagtgc tctgcgcaaa240cgtattcgag aggacagaaa ggccaccaca gctcagaagg tgcagcagat gaaacagcgt300ctgaatgaga atgaacgtaa aagaaaacgt ccacgcctga ctgacaccga atttatggtc360ccgctgcctg cgggcggagg gaccgtgctg accaagatgt acccgcgcgg caaccactgg420gcggtggggc acttaatg 438<210>10<211>203<212>PRT<213>人工序列
<400>10Arg Ser Thr Gly Leu Ser Ser Lys Met Gln Asp Thr Met Glu Glu Asn1 5 10 15Ser Glu Ser Ala Leu Arg Lys Arg Ile Arg Glu Asp Arg Lys Ala Thr20 25 30Thr Ala Gln Lys Val Gln Gln Met Lys Gln Arg Leu Asn Glu Asn Glu35 40 45Arg Lys Arg Lys Arg Pro Arg Leu Thr Asp Thr Phe Lys Thr Gly Leu50 55 60Ser Ser Lys Met Gln Asp Thr Met Glu Glu Asn Ser Glu Ser Ala Leu65 70 75 80Arg Lys Arg Ile Arg Glu Asp Arg Lys Ala Thr Thr Ala Gln Lys Val85 90 95Gln Gln Met Lys Gln Arg Leu Asn Glu Asn Glu Arg Lys Arg Lys Arg100 105 110Pro Arg Leu Thr Asp Thr Glu Phe Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala115 120 125Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser130 135 140Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr145 150 155 160His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp His Met165 170 175Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro180 185 190Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met195 200<210>11<211>621<212>DNA<213>人工序列<400>11
ggatccacag gtctttcctc taaaatgcaa gatacaatgg aggagaacag tgagagtgct 60ctgcgcaaac gtattcgaga ggacagaaag gccaccacag ctcagaaggt gcagcagatg120aaacagcgtc tgaatgagaa tgaacgtaaa agaaaacgtc cacgcctgac tgacaccttt180aaaacaggtc tttcctctaa aatgcaagat acaatggagg agaacagtga gagtgctctg240cgcaaacgta ttcgagagga cagaaaggcc accacagctc agaaggtgca gcagatgaaa300cagcgtctga atgagaatga acgtaaaaga aaacgtccac gcctgactga caccgaattc360gtttctgtgg aaaagcgcca ggctcctggc aaacgctctg agtctggctc cccttctgct420ggtggccaca gcaaacctcc tcacagccca ctggtcctca agcgctgcca cgtctccaca480catcagcaca actacgcagc gcctccgtcc actcgcaagg accatatggt cccgctgcct540gcgggcggtg gtaccgtgct gaccaagatg tacccgcgcg gcaaccactg ggcggtcggt600cacctgatgt gataactcga g 621<210>12<211>602<212>DNA<213>人工序列<400>12acaggtcttt cctctaaaat gcaagataca atggaggaga acagtgagag tgctctgcgc 60aaacgtattc gagaggacag aaaggccacc acagctcaga aggtgcagca gatgaaacag120cgtctgaatg agaatgaacg taaaagaaaa cgtccacgcc tgactgacac ctttaaaaca180ggtctttcct ctaaaatgca agatacaatg gaggagaaca gtgagagtgc tctgcgcaaa240cgtattcgag aggacagaaa ggccaccaca gctcagaagg tgcagcagat gaaacagcgt300ctgaatgaga atgaacgtaa aagaaaacgt ccacgcctga ctgacaccga attcgtttct360gtggaaaaga ggcaggctcc tggcaaaagg tcagagtctg gatcaccttc tgctggaggc420cacagcaaac ctcctcacag cccactggtc ctcaagaggt gccacgtctc cacacatcag480cacaactacg cagcgcctcc tccactggca aggaccatat ggtcccgctg cctgcgggcg540gagggaccgt gctgaccaag atgtacccgc gcggcaacca ctgggcggtg gggcacttaa600tg 602<210>13<211>213<212>PRT<213>人工序列<400>13Met Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln1 5 10 15
Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu20 25 30Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala35 40 45Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp50 55 60Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr65 70 75 80Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn85 90 95Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe100 105 110Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val115 120 125Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr130 135 140Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp pro145 150 155 160Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro165 170 175Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu180 185 190Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Asp Pro195 200 205Pro Lys Asp Glu Leu210<210>14<211>216<212>DNA<213>人工序列<400>14ctcgagtgga gagcatgggg agacccggga ccctgctggg tttctctgtc acaaaggaaa 60
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本发明涉及一种非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体能够包装与携带可表达出具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地进入特异性表达胃泌激素释放肽受体和癌胚抗原的肿瘤细胞，以使该表达重组体在该细胞内表达出杀伤蛋白，从而准确杀伤这种肿瘤细胞，而不伤及正常细胞。本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物及其应用。