专利名称：一种hvem基因在制备肝癌诊断和预后预测的产品中的应用的制作方法肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，目前已居我国肿瘤致死率的第二位，并有逐步增高的趋势，严重危害我国人民的健康。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗，但中晚期患者常失去手术机会。肝癌的恶性程度高，发展迅速，容易复发，致使目前总体疗效仍不理想，每年死亡人数与新增病例数几乎相等。驾驭免疫系统来攻克肝癌的想法很早以前就有人提出，但是到目前为止都没有取得预期效果。目前的研究认为，肿瘤细胞能通过变异和进化躲避机体的免疫监视，甚至抑制肿瘤特异的免疫应答，最终进入免疫逃逸阶段。在该阶段，肿瘤通过癌细胞本身和肿瘤间质，直接和间接地利用多种机制形成一个免疫抑制的肿瘤微环境，如同一个完善的免疫屏障，使得机体的抗肿瘤免疫无功而返。T淋巴细胞在活化时需要来自抗原受体即T细胞受体第一信号和由一系列表达于细胞表面的共刺激分子传递的第二信号。这些共刺激能调节淋巴细胞活化的程度、性质和持续时间。疱疫病毒侵入介体(herpes virus entry mediator, HVEM)是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，同时也是属于共刺激分子。HVEM主要表达于初始T细胞、NK细胞、B细胞和单核细胞，也可表达于一些非免疫细胞如肝细胞、肠上皮细胞和平滑肌细胞等。人们发现HVEM能同淋巴毒素a (LTa)和LT a同源分子配体一LIGHT相互作用。由于LIGHT同时具有诱导肿瘤细胞凋亡和共刺激T细胞活化的功能，它有希望为肿瘤的治疗带来新的方法。有研究表明，位于基质细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和肿瘤细胞株表面的HVEM与LIGHT结合后，导致肿瘤局部免疫效应细胞显著增加，产生强烈的抗肿瘤免疫，最终清除原发和转移的肿瘤。近年来肝癌的免疫治疗研究也在不断进行，如细胞因子、自体淋巴细胞活化回输、基于树突状细胞的免疫治疗和甲胎蛋白来源的多肽疫苗等。但是，这些试验的结果都不太理想。对于疗效欠佳的原因，除了免疫治疗措施本身在质和量上存在缺陷之外，肿瘤细胞利用各种免疫逃逸机制来摆脱机体免疫监视也为原因之一。基于此，要想成功实现肿瘤免疫治疗，探索肿瘤的免疫逃逸机制是极其关键的。由于HVEM担当着T细胞活化的开关分子作用，对T细胞的免疫反应起着共刺激信号，所以HVEM的异常表达，可能在T细胞介导的免疫增强中具有重要作用。绝大多数对HVEM免疫调节的研究，针对的是表达于免疫细胞表面的 HVHM分子。中国专利文献CN :101896198A公开了一种治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的HVEM配体，该发明涉及治疗血液恶性肿瘤，尤其是慢性淋巴细胞型白血病，以及治疗自身免疫性疾病的HVEM配体。中国专利文献CN 1891714A公开了一种单纯疱疹病毒进入介体HVEM的新配体(p30)，p30可用于调节免疫应答并可用于抑制疱疹病毒感染，也提供应用该发明P30治疗淋巴细胞疾病患者或患有或怀疑患有疱疹病毒感染的患者的方法。但是关于HVEM在实体肿瘤中的研究及其临床意义，以及HVEM在抗肿瘤中的作用机制目前还未见报道。
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种HVEM基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述的诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。所述的用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。所述的用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增HVEM基因的引物。所述的用免疫检测诊断肝癌的产品包括与HVEM蛋白特异性结合的抗体。本发明的再一的目的是，提供一种HVEM基因在制备预测肝癌预后的产品中的应用。本发明的第三个的目的是，提供一种HVEM基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明优点在于 首次发现了 HVEM在实体瘤组织的异常表达，本发明的HVEM基因，可作为诊断肝癌和预测肝癌预后的特异标志基因，使肝癌诊断和预后预测更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。附图I 是 Real-time PCR 结果图。附图2是实时定量PCR结果图。附图3 是 Western-blot 结果图。附图4是HVEM在肝癌组织显著低表达。附图5是HVEM在癌旁肝组织显著高表达。附图6是肝癌组织中HVEM表达较低者与较高者的无瘤生存率和总体生存率比较。附图7是各细胞株HVEM的表达情况。附图8是合成用于转染HVEM的质粒。附图9是成功转染SMMC-7721。附图10是上调HVEM后的SMMC-7721增殖减低。附图11是划痕实验示转HVEM组的肝癌细胞迁移能力明显下降。附图12是Transwell分析细胞侵袭能力。附图13是上调HVEM后的SMMC-7721成瘤的HE染色。
作详细说明。实施例I HVEM在肝癌和癌旁的表达情况I.材料与方法 1.1实验材料 I. I. I组织标本
免疫组织化学用组织来源103例肝癌(HCC)及相对应的癌旁组织石蜡切片来自东方肝胆外科医院病理科2004年I月-2004年6月行肝癌根治性切除术标本。Realtime-PCR、Western_blot 用组织来源2009 年 I 月-2009 年 6 月东方肝胆外科医院行肝癌根治性切除术的新鲜组织标本。1.1.2主要试剂 ⑴免疫组织化学用试剂
一抗(所用浓度I :200)，HVEM (N-19，SC-7766)，Stanta公司；抗体稀释液(长岛公司)；二抗(所用浓度I :200), HRP标记的兔抗羊IgG, ICL公司；用0. OlM PH7. 4 PBS稀释；BSA(鼎国生物)；1%BSA (0. OlM PBSPH7.4 IOml+ BSA IOOmg)；
抗原修复液
原液 A 液(0. 1M) 21. 01 克 C6H807.H20 (枸橼酸)+ 1000ML 双蒸水B 液(0. 1M) 29. 14 克 C6H5Na307. 2H20(枸橼酸钠)+IOOOml 双蒸水配液0. OlM枸橼酸缓冲液PH =6. 0+0. I 6. 0-0. I，A液9ml，B液41ml450 ml双蒸水，共500ml ；DAB显色试剂盒DAK0公司，按说明书操作；另外过程中浸洗所用PBS均为0. OlM PH7. 4溶液。(2) Realtime-PCR 试剂
5X RT缓冲液，2. 5 mM dNTP混合液，引物见表I。表I HVEM 和 act in mRNA RT-PCR 检测引物


本发明涉及一种HVEM基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。本发明还提供一种HVEM基因在制备预测肝癌预后的产品中的应用和一种HVEM基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明优点在于首次发现了HVEM在实体瘤组织的异常表达，本发明的HVEM基因，可作为诊断肝癌和预测肝癌预后的特异标志基因，使肝癌诊断和预后预测更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。