专利名称：一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途的制作方法 双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BsAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BsAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和效应细胞上的靶分子，直接触发效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前可通过化学工程、细胞工程以及基因工程等方法制备BsAb。基因工程法构建BsAb的最大优点是可对抗体进行工程化改造，如构建人源化BsAb、小分子BsAb、多价BsAb等。可采用基因工程技术设计、构建双价BsAb，其构建模式包括双特异性微抗体(Bispecific miniantibody)、双链抗体(Diabody)、单链双特异性抗体(Sc-BsAb)等。双价BsAb具有分子量小、肿瘤组织渗透性好、易于构建和表达等优点，但是由于它们对每一个特异性抗原仅有一个结合功能域，对靶分子的亲和力不高，导向效果较差。为提高BsAb的稳定性及治疗潜能，近几年又出现了四价BsAb的构建模式，如二聚化双特异性微抗体(Dimericbispecific miniantibody，Dibi Miniantibody)、四价双特异性抗体Tandemdiabody(Tandab)、IgG样双特异性抗体等，它们除具有双特异性的特征外，对每一个靶抗原又是双价的，因而对靶细胞有更高的亲和力及更强的效应功能，在人血清中的稳定性有所增强，在循环中的滞留时间亦明显延长。但由于四价BsAb对效应细胞(T淋巴细胞、NK细胞等)也是以双价结合，临床应用时可引起循环血液中效应细胞表面受体交联，导致效应细胞广泛活化，释放大量细胞因子(如TNFα等)，引起无法接受的毒性反应。过去十几年的动物和临床试验结果表明，有更大临床应用价值的BsAb应具有以下特性，(1)必须能够高选择性及高亲和性地结合肿瘤相关抗原；(2)在循环系统中，BsAb与效应细胞或细胞毒性触发分子应有相对较低的亲和力，从而能够限制全身性效应细胞活化引起的副反应，同时BsAb结合于表达靶抗原的肿瘤细胞时又必须能有效地诱导效应细胞的细胞毒性；(3)BsAb应为人源化的抗体，从而最大限度地减少人抗鼠免疫反应，使重复给药不受限制；(4)BsAb分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的循环滞留时间。目前采用人IgG1重链第一恒定区(CH1)和κ链恒定区(CL)结构域作为异二聚化结构域构建的二价双特异或三价三特异性抗体，它们对每一个特异性抗原仅有一个结合功能域，对靶分子的亲和力不高，导向效果较差。因此结构更加合理、功能效应更为强大的BsAb仍有待开发。
为解决目前双特异性抗体存在的不足，本发明公开了一种三价BsAb。本发明采用人IgG1重链第一恒定区CH1和κ链恒定区CL结构域作为异二聚化结构域，设计一种新型的三价BsAb。本发明的三价BsAb包括人IgG1重链第一恒定区CH1、κ链恒定区CL结构域、A抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL、B抗体的单链可变区scFv。在CH1的N端连接A抗体的重链可变区VH，在CH1的C端连接B抗体的单链可变区scFv(结构为VH-VL或VL-VH)，形成VH-CH1-scFv结构；在CL的N端连接A抗体的轻链可变区VL，在CL的C端连接B抗体的scFv，形成VL-CL-scFv结构；CH1和CL间自然二聚化形成三价BsAb，三价BsAb各结构域排列顺序及结构示意图见图1和图2。在三价BsAb中，A抗体识别效应细胞表面触发分子如CD3、CD16、CD64等，B抗体识别靶细胞表面标志如Her2/neu、CD20、CD30、EGFR等。本发明还公开了三价BsAb的制备方法，该方法包括以下步骤 (1)表达载体的构建 选择表达载体，构建三价双特异性抗体双顺反子表达载体。根据VL、CL、scFv、RBS(核糖体结合位点，序列为aaggag)、pelB(细菌信号肽序列，如序列表中序列15所示)、VH和CH1基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中VL和CL，VH和CH1间采用重叠延伸PCR法进行连接，RBS和pelB通过引物融合于VH的5′端。纯化回收PCR产物，分别酶切VL-CL片段，scFv片段，RBS-PelB-VH-CH1片段，各酶切片段依次插入载体中的多克隆位点，构建表达载体。(2)重组蛋白质BsAb在大肠杆菌中的表达、检测 将重组载体转化大肠杆菌，挑取单菌落培养，加入IPTG诱导，取样品进行SDS-PAGE和Western-blot检测BsAb的表达情况。(3)BsAb的纯化将 表达后的培养液离心收获菌体，PBS重悬，冻融，超声波破菌，离心，收获上清。上清用结合缓冲液稀释，过亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS-PAGE检测纯化蛋白质。
(4)FACS分析初步检测BsAb的结合活性①FACS分析BsAb与SK-BR-3细胞的结合活性。消化SK-BR-3细胞，用冷PBA离心洗涤，与BsAb振荡孵育，离心洗涤，与FITC标记的羊抗人IgG振荡孵育，离心洗涤，重悬细胞后，进行分析。
②FACS分析BsAb与CD16表面抗原阳性细胞的结合活性。取健康人外周血，分离单个核细胞，离心洗涤，与BsAb振荡孵育，离心洗涤，与藻红素酶标记的鼠抗人CD56、FITC标记的羊抗人IgG振荡孵育，离心洗涤，重悬细胞后，进行双色荧光分析。
本发明的三价双特异性抗体综合了以往二价双特异性抗体和四价双特异性抗体的优点，摒弃其缺陷，具有如下优点(1)三价BsAb对效应细胞以单价结合，在循环系统中，与效应细胞触发分子的亲和力较低，这样可以避免或减轻全身性效应细胞活化引起的副反应；(2)三价BsAb对靶细胞以双价结合，其对靶细胞具有更高的亲和力，增强了导向功能，用于体内治疗时将更快地定位于肿瘤部位，既可以增强效应功能，又能减少循环中双特异性抗体浓度，减轻副反应；(3)三价BsAb分子量约100kD，分子大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的循环滞留时间。
本发明所制备的抗体可以用于制备抗肿瘤的治疗药物，特别是对于肿瘤病人术后残留灶、转移灶的清除具有极为重要的应用价值。


图1 为三价BsAb各结构域排列顺序示意图。
图2 为三价BsAb各结构域结构示意3 为三价双特异性抗体表达载体中双顺反子结构示意图。其中P/O为T7启动子/lac操纵基因，RBS为核糖体结合位点，pelB为细菌信号肽序列，VL为抗人CD16轻链可变区序列，CL为人κ链恒定区序列，scFv为抗Her2/neu单链抗体可变区序列，VH为抗人CD16重链可变区序列，CH1为人IgG1重链第一恒定区。
图4 PCR扩增VL、VH、CL和CH1片段电泳图。其中1为VL；2为RBS-PelB-VH；3为DGL2000 DNA marker；4为CL；5为CH1图5 为PCR扩增scFv电泳图。其中1为scFv(EcoRI、HindIII)；2为DGL2000 DNA marker；3为scFv(NotI、XhoI)图6 为重叠延伸PCR法扩增VL-CL片段电泳图。其中1为DGL2000 DNA marker；2为VL-CL；图7 为重叠延伸PCR法扩增RBS-PelB-VH-CH1片段电泳图。其中1为RBS-PelB-VH-CH1；2为DGL2000 DNA。
图8 为重组载体命名为pET22b(+)/BsAb结构示意图。
图9 为SDS-PAGE检测BsAb在BL21(DE3)中的表达(沉淀)。其中1为LMW protein marker；2为control(空载体pET22b)，未诱导；3为control，IPTG 0.5mmol/L；4为control，IPTG 0.2mmol/L；
5为pET22b/VLCL+scFv，未诱导；6为VLCL+scFv，IPTG 0.5mmol/L；7为VLCL+scFv，IPTG 0.2mmol/L；8为pET22b/BsAb，未诱导；9为BsAb，IPTG 0.5mmol/L；10为BsAb，IPTG 0.2mmol/L。
图10 为Western-blot检测BsAb在BL21(DE3)中的表达，其中1为LMW protein marker；2为未诱导沉淀；3为未诱导上清；4为诱导沉淀；5为诱导上清。
图11 为SDS-PAGE检测纯化BsAb，其中1为LMW protein marker，2为纯化BsAb。
图13 为FACS分析BsAb与CD16表面抗原阳性细胞的结合活性，其中1为阴性对照 2为BsAb
实施例一 抗Her2/neu×抗CD16的三价BsAb的制备一、材料鼠抗人CD16单抗轻链、重链可变区基因(VL，VH)克隆自杂交瘤细胞B88-9，市购(实验方法参照《分子克隆》(科学出版社，第二版))；鼠抗P185erbB2单抗VL和VH基因克隆自杂交瘤细胞Her2(市购)，按常规方法合成scFv，VL与VH之间连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)3(参见《基因工程抗体》，董志伟，王琰主编)；人IgG1重链第一恒定区CH1和κ链恒定区CL基因由军事医学科学院童贻刚博士提供(GenBank AF027159，X95747)；大肠杆菌菌株JM109、BL21(DE3)，原核表达载体pET22b(+)为标准株，市购；高表达P185erbB2的人乳腺癌细胞SK-BR-3为标准株(ATCC NumberHTB-30)，购自中科院上海细胞生物研究所。亲和层析柱填料rProtein G Sepharose Fast Flow为Pharmacia Biotech公司产品；T4 DNA连接酶为Gibco BRL公司产品；VentDNA聚合酶、限制性内切酶为Biolab公司产品；质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒为北京鼎国生物技术公司产品；IPTG为SIGMA公司产品；淋巴细胞分离液为天津市川页生化制品有限公司产品；羊抗人IgG由本室自制；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，羊抗鼠IgG(HRP-GAH、HRP-GAM)，异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG(FITC-GAH)购自北京中山生物技术公司；藻红素酶标记的鼠抗人CD56(PE-MAH CD56)购自晶美生物工程有限公司。
二、方法与结果1、表达载体的构建选择pET22b(+)做为表达载体，构建三价双特异性抗体双顺反子表达载体，双顺反子结构见图3。根据VL、CL、scFv、核糖体结合位点(RBS)、细菌信号肽序列(pelB)、VH和CH1基因序列及pET22b(+)载体中的多克隆位点设计引物，见表1。其中VL和CL，VH和CH1间采用重叠延伸PCR法进行连接，RBS和pelB通过引物RBS/PelBl、PelB2、PelB3/VH5融合于VH的5′端。
表1 PCR引物序列

PCR扩增VL、VH、CL和CH1的条件为95℃ 2min，按下列参数循环25次94℃变性1min，56℃退火1min，72延伸45sec，最后一个循环72℃延伸10min。其中扩增VH的5`端引物为RBS/PelB1、PelB2和PelB3/VH5的混合物，将RBS和pelB融合于VH的5`端，见图4。
PCR扩增scFv的条件为95℃ 2min，按下列参数循环25次94℃变性1min，56℃退火1min，72延伸75sec，最后一个循环72℃延伸10min见图5。
重叠延伸PCR法连接VL和CL的条件为以等量纯化回收的VL和CL(约20ng)为模板并互为引物，其余试剂同常规PCR，按下列参数循环7次94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸40min；然后加入VL 5`端引物(VL5)和CL 3`端引物(CL3)，按下列参数循环25次94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸75sec，最后一个循环72℃延伸10min，见图6。
重叠延伸PCR法连接RBS-PelB-VH和CH1的条件为以等量纯化回收的VH和CH1(约20ng)为模板并互为引物，其余试剂同常规PCR，按下列参数循环7次94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸45min；然后加入VH 5`端引物(RBS/PelB1)和CH1 3`端引物(CH13)，按下列参数循环25次94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸80sec，最后一个循环72℃延伸10min，见图7。
DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物，NcoI、EcoRI双酶切VL-CL片段，EcoRI、HindIII双酶切scFv片段，HindIII、NotI双酶切RBS-PelB-VH-CH1片段，NotI、XhoI双酶切scFv片段，各酶切片段依次插入pET22b(+)载体中的多克隆位点，重组载体命名为pET22b(+)/BsAb，见图8。
2、重组蛋白质BsAb在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、检测将重组载体pET22b(+)/BsAb转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于含100mg/L氨卞青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约为0.4，加入IPTG至终浓度分别为0.2mmol/L和0.5mmol/L，室温，130r/min，继续培养3h。
SDS-PAGE检测表达情况。每个样品取1ml，10000g离心15min收获细菌菌体，重悬菌体于200μl PBS中，反复冻融三次，超声波破菌，4℃10000g离心15min，分别收集上清和沉淀，沉淀用150μl 1×凝胶加样缓冲液重悬。分别取上清(10μl+10μl SDS凝胶加样缓冲液)和沉淀进行10％SDS-PAGE。结果显示重组载体转化菌在分子量约50 kD处有新增蛋白质带，如图9所示。
Western-blot检测BsAb的表达将SDS-PAGE分离的蛋白质电转印至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的PBS于4℃封闭过夜。TBS(NaCl 150mmol/L，Tris-HCl 50mmol/L，pH7.5)洗涤三次，每次10min，加入TBS稀释的HRP-GAH，37℃孵育1h。TBS洗涤三次，每次10min，DAB系统显色。结果在分子量约50 kD处有特异蛋白质带显色，见图10。
3、BsAb的纯化冻存菌种37℃，120r/min过夜活化，取0.5ml活化菌接种至120ml LB培养基中(氨卞青霉素100mg/L)，37℃，250rpm震荡培养至OD600为0.5，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L，150r/min，30℃继续培养4h。4℃，4000g离心10min收获菌体，用20％初始培养液体积的PBS重悬菌体。悬液冻融一次，超声波破菌。4℃，12000g离心20min，收获上清。上清用10倍体积的结合缓冲液稀释(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4，150mmol/L NaCl)过rProteinG Sepharose Fast Flow亲和层析柱，100mmol/L甘氨酸，pH2.5洗脱缓冲液洗脱。洗脱蛋白质过YM-30kD超滤膜更换为PBS缓冲液。10％SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图11。
实施例二 FACS分析检测抗Her2/neu×抗CD16的三价BsAb的活性检测一、材料同实施例一。
二、方法与结果1、FACS分析BsAb与SK-BR-3细胞的结合活性0.02％EDTA消化SK-BR-3细胞，用冷PBA(PBS，2％BSA，0.1％NaN3)离心洗涤2次；与BsAb(0.1mg/L)0℃振荡培育30min，；以冷PBA离心洗涤2次，与FITC-GAH 0℃振荡培育30min；冷PBA离心洗涤2次，PBS重悬细胞，用Becton-Dickenson FACsort仪器进行分析。结果表明BsAb能与完整SK-BR-3细胞特异性地结合，相对平均荧光强度为92.08，是阴性对照的25.4倍，见图12。
2、FACS分析BsAb与CD16表面抗原阳性细胞的结合活性取健康人外周血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用冷PBA(PBS，2％BSA，0.1％NaN3)离心洗涤2次；与BsAb(0.1mg/L)0℃振荡培育30min，；以冷PBA离心洗涤2次，与PE-MAH CD56、FITC-GAH 0℃振荡培育30min；冷PBA离心洗涤2次，PBS重悬细胞，用Becton-Dickenson FACsort仪器进行双色荧光分析。结果表明BsAb能与NK细胞亚群特异性地结合，见图13。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120>一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途<130>
<160>15<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>
<400>1catgccatgg acaccgtgct gaccca 26<210>2<211>17<212>DNA<213>
<400>2tccgttttat ttccagc 17<210>3<211>29<212>DNA<213>
<400>3tggaaataaa acggactgtg gctgcacca29<210>4<211>39<212>DNA<213>
<400>4ggaattcaga accaccgccg ccgcactctc ccctgttga 39<210>5<211>24<212>DNA<213>
<400>5ggaattccag gtacaactgc agca 24
<210>6<211>27<212>DNA<213>
<400>6cccaagctta tttgatttcc aattttg 27<210>7<211>41<212>DNA<213>
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<213>
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<400>14ccgctcgagt tattatttga tttccaattt 30<210>15<211>66<212>DNA<213>
<400>15atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60atggcc 6

本发明公开了一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途。本发明的三价双特异性抗体包括人IgG1重链第一恒定区CH1、к链恒定区CL结构域、A抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL、B抗体的单链可变区scFv。其中VH连接在CH1的N端，scFv连接在CH1的C端，VL连接在CL的N端，scFv连接在CL的C端。本发明的双特异性抗体制备方法包括表达载体的构建、双特异性抗体的表达及检测、双特异性抗体的纯化、双特异性抗体的结合活性分析等步骤。本发明的三价双特异性抗体具有副作用小、导向性好等优点，可以用于制备肿瘤的治疗药物。