专利名称：一种d-核糖发酵过程的调控方法D-核糖的制备方法包括从天然物质中提取分离、化学合成和微生物发酵等方法。从天然物中提取分离D-核糖，提取过程繁杂、制造成本高，不适合规模化生产。就合成法而言，人们先后尝试了从D-阿拉伯糖(Gehrke and Aichner，1927)、D-葡萄糖酸(Steiger，1936)、D-葡萄糖(Korczynski A et al.1979)、L-谷氨酸和D-木糖(Lacourt Gadras，et al.1992)合成D-核糖，20世纪八十年代以前，国内外主要采用由葡萄糖化学合成法进行D-核糖的工业化生产，即由葡萄糖经氧化、置换、转化、再置换、酸化、内酯化、还原等七步反应制得D-核糖，该法不仅步骤复杂、所用设备多、收率低、制造成本高，而且其所涉及的贡电极还原反应还会造成严重的环境污染。进入20世纪九十年代后，人们开始使用微生物发酵法生产D-核糖，发酵法在常温常压下进行，原材料来源广泛，又避免了化学合成法的环境污染，被称为生产D-核糖的最佳方法，也是具有很大的工业化生产潜力的方法。发酵法生产过程是一个非常复杂的化学变化和生理变化综合过程，提高发酵水平有两条途径，一是筛选出优良的菌种，二是得出与目的菌株相匹配的最佳培养条件、控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究上的菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵控制技术。只有两者紧密地结合才能最终实现高水平的发酵生产。长期以来，人们较多地将工作重点放在高产菌株的选育上，有关发酵过程进行优化与控制的研究较少。实际生产中所需的一些培养控制条件、技术指标往往在摇瓶条件下获得，这种低水平的研究方法客观上制约了菌种潜力的进一步发挥。不仅如此，由于在摇瓶条件下无法对目的微生物生理生化特性、营养供给及操作、发酵设备三方面之间建立起有机的联系，当反应器规模发生变化时，发酵结果常常不能重复。而这一点也正是有些发酵产品随着生产规模的扩大(从摇瓶到中试至大生产)过程发酵水平降低的根本所在。对发酵过程进行优化控制的目的，是同时获得最高的产物浓度、最高的生产强度(通常为每立升发酵液每小时转化为产物的量，常以g/L·h为单位)和最高的转化率。而当试图用分批发酵获得更高的产物浓度时，必然意味着转化率和生产强度的进一步下降。近年来发酵行业中关于发酵参数优化控制和流加发酵最优化的研究，为提高分批发酵的生产水平提供了可能的途径。在一定的初糖浓度下发酵，在发酵参数优化控制条件下，通过流加方式提高总糖浓度，并维持发酵过程的糖浓度于合适的水平，就有可能同时获得高的转化率、高的生产强度和高的产物浓度。对D-核糖发酵而言，多年来人们的目光多集中在优良菌株的筛选、培养基配方的改进等方面，对于需要通过氧化磷酸化途径才能形成的D-核糖发酵显得尤其重要的发酵参数(如溶氧、通气量与pH值、罐压及搅拌转速)的综合控制，在以往的文献中只是很模糊地提及，或只是对其中的某个参数进行报道。如发酵过程中pH的控制，多为只控制发酵培养基起始pH值或只提及某个最佳pH值(Asain and Kono 1984；Asain et al1978；Sasajima and Yoneda 1989)，而对整个发酵过程的pH控制，未见论述；又如阐述了在发酵过程中控制高溶氧水平有利于D-核糖的积累，但并未揭示出发酵各阶段对氧的需求(P.De Wulf E.J.Vandamme，J ApplMicrobiol 1997)；现有核糖高产菌株的发酵周期比较长，一般在60～90小时，有的甚至超过了100小时(P.De Wulf E.J.Vandamme，ApplMicrobiol Biotechmol 1997，48141～148)，见表一。尽管有些菌株在发酵培养基中积累的D-核糖含量高达90g/L以上，由于对发酵过程没有有效的控制，多数发酵周期长达72小时以上，甚至144小时(见表1)，其生产强度不能令人满意。表一不同菌株的核糖发酵周期 目前D-核糖发酵生产法中，多采用的微生物为芽孢杆菌属的菌株，其中以使用枯草芽孢杆菌属和短小芽孢杆菌属的菌株居多。而关于这些菌株D-核糖发酵过程的优化控制尚未出现成熟的方法。D-核糖发酵是一门年轻的学科，对其发酵过程进行优化控制研究，确定其最佳的优化控制条件，是发酵工业实现高效稳定生产的前提。


技术方案影响D-核糖发酵的因素可分为两类一类是发酵过程的环境参数，如温度、罐压、搅拌转速、pH值、溶氧等，另一类是关键变量，如菌体生长量、底物消耗速率、产物形成速率等。
本发明采用先进的发酵过程集散控制系统-FPC型集散控制系统(DCS)，对第一类环境参数进行在线控制和监测，并结合定时取样测定发酵过程第二类关键变量的方式，对核糖发酵过程的控制进行系统研究，确定核糖发酵不同阶段各个参数的最佳控制条件，在此基础上对流加补糖的控制条件进行了探索，确定了一种以溶氧、pH值控制为主线，综合控制发酵过程中各种参数、并适时流加补糖的有效调控方法。
更具体地说，本发明的D-核糖发酵过程的调控方法具有以下特征以发酵过程集散控制系统-FPC型集散控制系统(DCS)在线控制D-核糖发酵的培养温度、搅拌转速、罐压以及发酵不同阶段的pH值、溶氧量，并定时取样测定发酵过程中菌体细胞浓度、底物浓度以及产物生成量，在糖浓度低于临界值时流加补糖，保持发酵过程始终处于最佳状态。
该方法是一种以控制溶氧、pH值为主线，以控制菌体生长量、底物消耗速率及产物生成速率等关键变量为主要内容，并适时流加补糖的发酵控制方法。
该方法通过使用发酵过程集散控制系统-FPC型集散控制系统(DCS)在线综合控制溶氧、pH值以及发酵过程中其它参数(如培养温度、罐压、搅拌转速)，确定并保持最佳发酵条件；通过测定菌体细胞浓度、底物浓度以及产物生成量，取得发酵过程中菌体生长速率、底物消耗速率和产物生成速率等关键变量的变化规律，并结合不同初糖浓度发酵试验结果，确定最佳发酵初糖浓度、流加补糖时机和补糖方式。在此基础上，以最佳发酵条件，最佳发酵初糖浓度进行发酵，并在发酵过程中适时补糖(葡萄糖)，由此完成优化控制的核糖发酵过程。
以上所说的发酵过程包括使用各种微生物发酵制备D-核糖的过程，其中优选的是使用芽孢杆菌属菌株的发酵制备D-核糖的过程。
在上述方法中，其中所说的发酵过程中的培养温度在36～38℃范围内，罐压在0.5～0.8kg/cm2范围内，搅拌转速在180～220转/分范围内。
在上述方法中，其中所说的发酵不同阶段的最佳pH值范围分别为发酵前期(0～18小时)6.50～7.0；发酵中后期(18小时以后)6.00～6.50。
在上述方法中，其中所说的发酵不同阶段的最佳溶氧范围分别为发酵前期(0～18小时)18～30％；发酵中后期(18小时以后)20～35％。
在上述方法中，其中所说的糖浓度的临界值为2.5％，流加补糖的方式是以100-130升/小时的流速流加葡萄糖溶液，使发酵培养基中的葡萄糖含量恒定在2.5％-3.0％的范围内，所流加的葡萄糖溶液的浓度为30-50％，体积为发酵罐体积的10-20％。
发酵过程控制包括稳定操作条件和优化发酵参数两个方面，前者可通过常规调节回路来实现，而系统的优化控制需根据发酵过程的关键变量的变化规律，对罐温、罐压、pH、溶氧等进行寻优计算，以确定这些变量的最优控制策略。对此，采用常规仪表无法实现。而采用集散控制系统进行生化过程自动控制具有简单、可靠、高性能的特点。
本发明的方法中使用的FPC型集散控制系统(DCS)(如图1所示)由上位机和智能仪表、远程I/O模块构成，通过过程总线取得联系。控制软件是在WIN98环境下用VISUAL BASIC6.0开发的组态控制软件。其中使用的上位机是工控机，控制柜直接通过智能仪表进行控制。
智能仪表的功能是变送、数显、PID自整定控制、手操、无扰动切换、RS485通讯；远程I/O模块的功能是A/D变换、I/O输入输出、RS485通讯；智能仪表和远程I/O模块主要完成各参数实时测定和控制。通过测量变送器对发酵过程搅拌电流、罐温、罐压、进气流量、pH、溶氧、泡沫等进行实时测量，所有数据通过现场总线送上位机分析、储存。同时上位机根据控制要求按设定值进行连续控制，主要控制量有罐温、罐压、进气流量、pH、溶氧、消泡、补料等，并通过分析定时存储，并及时在显示器上显示，如果有异常立即报警，实现对发酵过程环境参数进行全面监测和闭环控制，使发酵生产的可再现性提高。
FPC型集散控制系统(DCS)具有如下功能(1)、数据采集和处理对罐温、罐压、进气流量、pH、溶氧、消泡、补料等发酵参数，实现可靠的在线测量，并通过分析定时存储，及时在显示器上显示，如果有异常立即报警，实现对发酵过程环境参数进行全面监测和闭环控制。
(2)、发酵过程顺序控制按逻辑功能完成发酵过程灭菌、接种培养、进出料等相应阀门的开、关，搅拌电机的启停等操作，使之既安全又减低劳动强度，从而提高运行可靠性。
(3)、直接数字控制和设定值控制对罐温、罐压、进气流量、pH值等参数可很方便地实现各种反馈控制(如PID控制、串接控制、自适应控制等)，并可根据优化操作要求去改变设定值。
(4)、优化控制通过罐温的优化、pH值的优化及氧传递过程的优化等，确定发酵优化控制的条件，实现发酵生产的可控性操作，提高发酵产率、缩短发酵时间。
该系统的主要仪表选型如下温度防水型铂热电阻Pt100；
压力电容式压力变送器、隔膜式压力表；流量旋涡流量变送器(抗震型)、玻璃浮子流量计；泡沫电容式数字物位开关；pH耐高温pH值测量系统(瑞士Mettler Toledo公司传感器、新加坡EUTECH INSTRUMENTS公司产的送变器)溶氧耐高温溶氧测量系统(瑞士Mettler Toledo公司传感器、新加坡EUTECH INSTRUMENTS公司产的送变器)搅拌电流电流互感器控制仪表带RS485通信的小型智能调节仪表调节阀气动薄膜调节阀、耐高温耐腐蚀的电磁阀按照中国专利法和其实施细则的规定，本发明的短小芽孢杆菌P8069和枯草芽孢杆菌S6023已于2002年12月5日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号分别为CGMCC0845和CGMCC0846。
有益效果通过对D-核糖发酵过程的优化控制，包括以溶氧和pH值的控制为主线，对发酵过程各种参数进行综合参数、并适时补糖等控制方法，D-核糖产糖水平可提高20～34％，发酵周期缩短至42～50小时，发酵罐的装填系数由70％提高至80％以上，并且发酵过程易于控制、重复性增强。


图1是本发明的集散控制系统总体结构图。

以下以非限制性实施例进一步说明本发明。以下各实施例中使用的葡萄糖含有1分子结晶水，折纯含量为90％。
实施例1使用短小芽孢杆菌(B.pumilus)CGMCC0845。在由山梨醇2.0％(w/w)，玉米浆2.0％，酵母膏0.1％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％组成的350L种子培养基(pH7.0)中，控制种子罐罐压1.0kg/cm2，转速200转/分，培养温度36℃，培养16小时后接入由葡萄糖16.0％(w/w)，玉米浆2.6％，酵母膏0.1％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃。在发酵前期0～18小时，控制在pH6.5～7.0、溶氧20～25％；发酵中后期控制在pH6.3～6.5、溶氧25～30％。发酵前18小时，葡萄糖消耗缓慢，主要是菌体生长阶段。发酵18小时后，葡萄糖消耗开始加快，D-核糖开始积累，菌体生长速度略有下降。到24小时时，菌体生长进入稳定期，菌体生长量达到15g湿菌体/100ml发酵液。随着葡萄糖消耗速度的加快，产物积累，进入快速产糖期，这一阶段的糖耗速度很快约为每小时0.6～0.8％，产物形成进入高峰期，转化率约可达到50～55％(重量转化率)有时甚至达到60％以上。在发酵培养32小时，发酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，此时，控制发酵液中的糖浓度在2.5～3.0％范围内，以120升/小时流速开始流加补糖，流加的糖浓度为40％，体积550L。流加补糖结束后，维持上述控制条件，继续培养45小时，葡萄糖耗尽，pH值和溶氧直线上升，发酵结束，发酵液中D-核糖的含量为90.60g/L，发酵液体积为4050L。
比较实施例1-1(不补糖，控制条件相同，初糖浓度提高)使用短小芽孢杆菌CGMCC0845。用与实施例1培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米浆2.5％，干酵母0.1％，硫酸铵0.6％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。发酵不同阶段各个参数的控制条件与实施例1完全相同，发酵培养45小时，发酵液中D-核糖的含量为73.65g/L，发酵液体积为3500L。
比较实施例1-2(不补糖，控制条件简化，初糖浓度提高)使用短小芽孢杆菌CGMCC0845。用与实施例1培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米浆2.5％，干酵母0.1％，硫酸铵0.6％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃，按1∶0.9的通风量，在36℃下通气搅拌培养52小时，发酵液中D-核糖的含量为69.60g/L，发酵液体积为3500L。
实施例2使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)CGMCC0846。在由葡萄糖2.0％(w/w)，酵母膏0.3％，玉米浆0.05％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％(pH7.0)组成的350L种子培养基中，控制种子罐罐压1.0kg/cm2，转速200转/分，培养温度36℃，培养18小时后，接入由葡萄糖16.0％(w/w)，玉米浆2.6％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃。在发酵前期0～18小时，控制在pH6.5～7.0、溶氧18～22％；发酵中后期控制在pH6.0～6.2、溶氧20～25％、；在36℃、0.60kg/cm2的下通气搅拌培养。发酵前18小时，葡萄糖消耗缓慢，主要是菌体生长阶段。发酵18小时后，葡萄糖消耗开始加快，D-核糖开始积累，菌体生长速度略有下降。到24小时时，菌体生长进入稳定期，菌体生长量达到16g湿菌体/100ml发酵液。随着葡萄糖消耗速度的加快，产物积累，进入快速产糖期，这一阶段的糖耗速度很快约为每小时0.7～0.9％，产物形成进入高峰期，转化率约可达到50～55％(重量转化率)有时甚至达到60％以上。在发酵培养33小时，发酵液中的葡萄糖降至2.5～2.8％，这时，控制发酵液中的糖浓度在2.5～2.8％范围内，以120升/小时的速度，开始流加补糖，流加的糖浓度为45％，体积600L。补糖结束后，维持上述控制条件，发酵培养46小时，葡萄糖耗尽，发酵结束，此时发酵液中D-核糖的含量为91.35g/L，发酵液体积为4100L。
比较实施例2-1(不补糖，控制条件相同，初糖浓度提高)使用枯草芽孢杆菌CGMCC0846。用与实施例1培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米浆2.6％，硫酸铵0.7％；硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。发酵不同阶段各参数的控制与实施例4相同，发酵培养42小时，葡萄糖耗尽发酵结束，此时发酵液中D-核糖的含量为75.60g/L，发酵液体积为3500L。
比较实施例2-2(不补糖，控制条件简化，初糖浓度提高)使用枯草芽孢杆菌CGMCC0846。用与实施例1培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，玉米浆2.6％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃，按1∶0.8的通风量，在36℃下通气搅拌培养56小时，发酵液中D-核糖的含量为68.60g/L，发酵液体积为3500L。
实施例3使用短小芽孢杆菌ATCC31093。在由山梨醇2.0％，玉米浆2.0％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钾0.1％，酪氨酸和苯丙氨酸各100μg/ml(pH7.0)组成的350L种子培养基中，控制种子罐罐压1.0kg/cm2，转速200转/分，培养温度36℃，培养16小时后接入由葡萄糖16.0％(w/w)，干酵母1.2％，硫酸铵0.6％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中，采用与实施例1相同的发酵控制条件，在发酵培养33小时，发酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，控制发酵液中的糖浓度在2.5～3.0％范围内，以120升/小时的流速开始流加补糖，流加的糖浓度为40％，体积550L。发酵培养48小时，葡萄糖耗尽，pH、溶氧直线上升，发酵结束，此时发酵液中D-核糖的含量为89.79g/L，发酵液体积为4050L。
比较实施例3-1(不补糖，控制条件相同，初糖浓度提高)使用短小芽孢杆菌ATCC31093。用与实施例3培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.2％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。除不进行流加补糖外，发酵不同阶段各个参数的控制条件与实施例1完全相同，发酵培养45小时，葡萄糖耗尽，pH、溶氧直线上升，发酵结束。发酵液中D-核糖的含量为75.65g/L，发酵液体积为3500L。
比较实施例3-2(不补糖，控制条件简化，初糖浓度提高)使用短小芽孢杆菌ATCC31093。用与实施例3培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.2％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃，按1∶0.8的通风量，在36℃下通气搅拌培养58小时，发酵液中D-核糖的含量为66.79g/L，发酵液体积为3500L。
实施例4使用枯草芽孢杆菌IFO13621。用与实施例3培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，培养温度36℃，培养18小时后接入由葡萄糖16％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸铵0.6％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中，采用与实施例2相同的发酵控制条件，在发酵培养32小时，发酵液中的葡萄糖降至2.5～3.0％，控制发酵液中的糖浓度在2.5～3.0％范围内，以120升/小时的流速开始流加补糖，流加的糖浓度为40％，体积400L。发酵培养48小时，葡萄糖耗尽，pH、溶氧直线上升，发酵结束，此时发酵液中D-核糖的含量为85.29g/L，发酵液体积为4100L。
比较实施例4-1(不补糖，控制条件相同，初糖浓度提高)使用枯草芽孢杆菌IFO13621。用与实施例4培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸铵0.6％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。发酵不同阶段各个参数的控制条件与实施例2完全相同，发酵培养45小时，葡萄糖耗尽，pH、溶氧直线上升，发酵结束，发酵液中D-核糖的含量为70.15g/L，发酵液体积为3500L。
比较实施例4-2(不补糖，控制条件简化，初糖浓度提高)使用枯草芽孢杆菌IFO13621。用与实施例4培养基组成相同、培养条件相同的350L种子培养基，36℃培养18小时后，接入由葡萄糖21.88％(w/v)，干酵母1.0％，硫酸铵0.7％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2.2％，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各50μg/ml组成的3200L发酵培养基(pH7.0)中。控制搅拌转速180转/分，培养温度36℃，按1∶0.8的通风量，在36℃下通气搅拌培养58小时，发酵液中D-核糖的含量为65.27g/L，发酵液体积为3500L。


本发明涉及一种D－核糖发酵过程优化的调控方法。该方法是一种以控制溶氧、pH值为主线，以控制菌体生长量、底物消耗速率及产物生成速率等关键变量为主要内容，并适时流加补糖的发酵控制方法，在5000l发酵罐发酵结果表明，应用该方法，D－核糖产糖水平可提高20～34％，发酵周期缩短至42～50小时，发酵罐的装填系数由70％提高至80％以上，并且发酵过程易于控制、重复性增强。