一种源于中华鳖的抗微生物肽及其基因、制备方法和应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明提供一种来源于中华鳘(Pelodiscus sinensis)的cathelicidin家族广谱抗微生物肽PS-CATH4及其编码基因，主要应用在制备抗病原微生物感染药物及在化妆品、保健品、食品、饲料的添加剂中，属于生物医学【技术领域】。[0002]Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的宿主抗菌肽家族，结构特点是:具有N端信号肽区域(30个残基左右)、中间保守cathelin结构域(99 114个残基)和C端高度特异的成熟肽区域(12 100个残基)。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，能快速、广谱地杀灭多种病原微生物，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、寄生虫和病毒等，特别是对许多临床耐药细菌同样具有作用，这引起了人们的注意。除此之外，cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。这些优势使其在临床的应用有着良好的前景。[0003]近年来由于抗生素的滥用，各种耐药及超级耐药菌层出不穷，对临床的抗感染治疗造成巨大威胁，因此新型抗病原微生物模板的研发迫在眉睫。Cathelicidins对许多临床耐药细菌有着很强的杀菌活性，对许多致病菌杀害作用的速度要远远大于传统抗生素的作用，体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。最重要的是由于其特别的杀菌机制，不会引起耐药性。目前发现的Cathelicidins的杀菌机 制有很多，常见的是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的即通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。此外，抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不会产生耐药性。[0004]关于抗菌肽药物，目前cathelicidin的研究热点主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，应用方式可以是局部的也可以是系统的，剂型可以是口服也可以外用。尤其由于阳离子抗菌肽的表达与皮炎、侵入性烧伤脓血症、肿瘤病毒引起的肉赘等之间的病理联系，这些抗菌肽对这些疾病的局部治疗有较好的开发前景。目前有部分抗菌肽药物已进入临床试验阶段，例如Pexiganan是爪蟾抗菌肽Magainin的类似物，目前已作为治疗足部感染药物进入临床试验阶段，它也是第一个进行商业开发的抗菌肽；Hlfl-ll是人乳铁蛋白前11个氨基酸残基组成的抗菌肽，通过I / II期临床试验研究表明Hlfl-1通过静脉给药时是安全的、耐受性良好的；来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床III期试验等。Cathelicidin的应用不仅限于医药领域，在农业、畜牧业和日化用品领域，cathelicidin也存在巨大的应用潜能。[0005]化妆品添加剂指的是在化妆品的基础配方必须要用的原料之外的成分，而大多数化妆品基础配方最主要的原料应该是油脂，水和表面活性剂，因此其他组分如香精，防腐剂，色素，保湿剂，美白剂以及所有的功能性原料都属于添加剂。有报道称日本政府规定了约有102种化学添加物对皮肤有害，包括香精香料，化妆品用色素，化妆品用防腐剂，表面活性剂和部分油脂。而抗菌肽具有抗菌活性以及抗氧化活性，可以替代有害的添加剂如防腐剂，抗氧化剂。另外，关于抗菌肽在添加剂中的作用，完全不局限于化妆品，比如食品的添加剂，是指为了改善食品品质，或满足食品保鲜、防腐和加工工艺的需要而加入到食品中的人工合成物或天然物质，如漂白剂，防腐剂，着色剂，香精香料，抗氧化剂等，其中防腐剂能抑制食品微生物生长和繁殖，延长食品的保存时间，抗氧化剂是为控制食品的氧化，尤其是控制油脂食品的“酸败”起了重要作用，但是这些添加剂往往被擅自滥用，给人身体带来巨大伤害，特别是有致癌的副作用，所以可以用抗菌肽替代防腐剂和抗氧化剂。[0006]2002年，世界卫生组织(W H O)发表公告指出“在牲畜养殖过程中，停止以往惯用的饲料添加剂抗生素的做法，将在不危害动物和农民利益的前提下，可减少对人类健康的威胁“。抗生素作为饲料添加剂应用于动物生产中，对畜牧业的发展起了重要的作用，但是其在动物体内和动物产品中的残留，以及病原菌产生的抗药性问题，对人类的健康和环境产生了负面的影响。并且完全使我国出口肉类，海产品等受到了限制，从而影响收益。寻找新型、安全的抗菌剂代替抗生素，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。抗菌肽具有广谱的抗菌作用，对畜禽具有促生长和治疗疾病的功能，是无毒、无害、无残留的绿色产品，有望成为抗生素的替代品，在畜牧生产上发挥重要的作用。目前在畜禽生产，水产养殖等均有应有。[0007]中华鳘又名水鱼、甲鱼、团鱼,是常见的养殖龟种。野生中华鳖在中国、日本、越南北部、韩国、俄罗斯东部都可见。水栖性，常栖息于沙泥底质的淡水水域。有上岸进行日光浴的习性。肉食性，以鱼、虾、软体动物等为主食，多夜间觅食。中华鳖属于龟鳖目鳖科鳖亚科中华鳖属，目前关于中华鳖cathelicidin宿主防御肽的研究和应用还没有报道。

[0008]本发明提供一种来源于中华鳘(Pelodiscus sinensis)的cathelicidin家族广谱抗微生物肽PS-CATH4及其编码基因，主要应用在制备抗病原微生物感染药物及在化妆品、保健品、食品、词料的添加剂中。
[0009]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:
一种源于中华鳖的抗微生物肽PS-CATH4，所述抗微生物肽PS-CATH4是一种碱性的直链多肽，含有32个氨基酸残基，理论等电点为12.9，分子量是3913.68道尔顿，其全序列一级结构为:苏氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-色氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-天冬酰胺-精氨酸-色氨酸-谷酰胺-异亮氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-苏氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸。
[0010]编码抗微生物肽PS-CATH4前体cathelicidin的基因由483个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:Iatggagacct gcctgaaaat cctgctgctc gtcggggtgg tcacagcagc ccccacgtca
61 cccgcatctt ctctgccatc ccacgaggat gcgattttag cagcagtaca ggtgtacaac
121 caagagccag gcgtaacgct ggcctaccgg ctcctggaag cggagcctca gccagactgg
181 gacgtgactt cgaaaactgt ccagccgctg aaatttacta ttaaagagac agtgtgcctg
241 atctcggaga aacgcgacat caaccaatgc gatttcaaag aagacgggct gatcaaagac
301 tgctctggat tcttctccac tgaacaggac cccccctctg ccatgatcaa atgcgaggat
361 gcgtctgagg agcctgatat cgtcacccgg ggccgctggg ggagattcaa gaggagagcg
421 ggtaggttta ttcgcagaaa tcgctggcaa atcatttcga ctggtctcaa gctgattggc
481 tag
其中385到480是编码抗微生物肽Ps-CATH4的核苷酸序列。
[0011]抗微生物肽PS-CATH4的合成包括以下步骤:(I)根据所述抗微生物肽Ps_CATH4的核苷酸序列编码的Ps-CATH4氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成得到抗微生物肽Ps-CATH4的全序列；
(2)通过HPLC反相柱对所述抗微生物肽PS-CATH4的全序列进行层析脱盐纯化，并确定纯度大于97%，得到抗微生物肽PS-CATH4 ；
(3)用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定所述抗微生物肽PS-CATH4的分子量；等电聚焦电泳测定所述抗微生物肽PS-CATH4的等电点，用自动氨基酸测序仪测定所述抗微生物肽PS-CATH4的氨基酸序列结构。
[0012]所述抗微生物肽PS-CATH4作为制备抗病原微生物感染的药物或作为化妆品、保健品、食品、词料中的添加剂。
[0013]所述编码抗微生物肽PS-CATH4的核苷酸序列据其推测合成的抗微生物肽Ps-CATH4溶于灭菌超纯水，应用于药理活性检测。
[0014]本发明的有益效果在于:经过中华鳖肝脏总RNA提取、mRNA纯化、mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，再利用PCR方法筛选得到中华鳖抗菌肽PS-CATH4基因；再通过化学合成方法得到抗微生物肽PS-CATH4，它是直链多肽，含有32个氨基酸残基，理论等电点为12.9，分子量是3913.68Da。该抗微生物肽富含碱性氨基酸，具有很强的抗菌活性，其对多种临床耐药菌也有较好的杀灭作用；还具有低溶血、低细胞毒、不易产生耐药性等有益特点，且结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备。故可作为制备抗病原微生物感染的药物或作为化妆品、保健品、食品、饲料中的添加剂，有很好的应用前景。



[0015]图1是抗微生物肽PS-CATH4的杀菌动力学。

[0016]下面结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但本发明的内容并不局限于此。
[0017]实施例1抗微 生物肽PS-CATH4前体cathelicidin的基因提取
(I)中华鳖肝脏总RNA提取(以下实验所用器具和试剂均经过处理，无RNase)A.从新鲜宰杀的中华鳖各种新鲜组织上分别剪下Ig左右的小块，分别放入液氮预冷的细胞冻存管中，然后迅速放入液氮中保存；
B.将保存在液氮中的组织材料取出，放入预冷的研钵内，迅速充分研磨，期间不断向研钵内加入少许液氮；将大约30 mg的组织粉末转移至预冷的1.5 ml离心管中，向其中分别加入400 μ I Buffer R-1 (裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中，加入150 μ I Buffer R-Π，涡旋振荡15_30s，4 C，12000 rpm 离心 5 min ；
C.将离心后的上清转移至新的1.5 ml离心管中，加入250ul异丙醇，迅速吸打混匀；将混合液分别转移至离心吸附柱，室温，6000 rpm离心Imin ;弃废液,然后加入500 μ I BufferWlA, 4 C，12000 rpm 离心 Imin ;弃废液，加入 700 μ I Bufferff2A, 4 C，12000 rpm 离心Imin ;弃废液,加入700 μ I Buffer W2A, 4 C，12000 rpm离心I min;弃废液，空管12000 rpm离心I min ;将离心吸附柱转移至新的1.5 ml离心管中，然后直接向吸附膜上滴加 70-100 μ I Buffer TE，室温放置 Imin, 12000 rpm 离心 I min 洗脱得到总 RNA0
[0018](2)cDNA文库的构建 第一链的合成(mRNA反转录):
A.在新的0.2ml PCR管(无DNase和RNase)中配制下列混合液:
将 I μ g 的模板 RNA、1 μ I 的 3’ In-Fusion SMARTer CDS Primer (50 μ Μ)及 2.5 μ I的去离子水混合均匀，短暂离心；PCR仪中72 C保温5 min后，然后42 C2 min ;短暂离心后，在上述管中配制如下反转录反应液:
将 4.5μ I 的上述混合 液、2.0 μ I 的 5Χ First-Strand Buffer,0.25 μ I 的 DTT(100 mM) ,1.0μ I 的 dNTP Mix (10 mM )、1.0μ1 的 SMARTer V Oligonucleotide (12μ Μ),0.25 μ I 的 RNase Inhibitor (40U/ μ I)及 1.0μ1 的 SMARTScribe ? ReverseTranscriptase (100 U)*混合均匀后,短暂离心；在PCR仪中完成以下程序:42 C,90min ；68 C，IOmin ;4 C，保存。cDNA 保存于-80 C。
[0019]第二链的合成:
将 2μ I 的第一链 cDNA ,80 μ I 的去离子水、10 μ I 的 IOXAdvantage 2 PCR buffer、2μ I 的 50 X dNTP Mix、2 μ I 的 5，PCR primer,2 μ I 的 In-Fusion SMARTer CDSIIIprimer及 2μ I 的 50XAdvantage 2 Polymerase Mix 混合。
[0020](3)采用半巢式PCR进行中华鳖cathelicidin的基因克隆筛选
引物使用前先12000 rpm离心5min，然后根据标明的摩尔数加入相应体积的ddH20溶解至20 μ M的浓度。以合成的肝脏cDNA为模板，以Pl和In-Fusion SMARTer⑶S为引物，进行第一次PCR扩增。在0.2ml PCR管中加入8 μ I的ddH20、l μ I的cDNA模板、0.5 μ I的正向引物 Pl (20 μ Μ)、0.5μ I 的反向引物 In-Fusion SMARTer CDS (20 μ Μ)和 10 μ I 的
2XPfu PCR MasterMix，混匀后，短暂离心。PCR条件为:94 C变性5min ;25个循环:94 C变性30s，60 C退火30s，72 C延伸Imin ;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反应结束后，取5 μ I产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
[0021]取上步PCR产物I μ I加入99 μ I ddH20稀释100倍作为模板，以P2和CDS III为引物，进行第二次PCR扩增。在0.2 ml PCR管中先后加入7 μ I的ddH20、l μ I的一次PCR产物稀释液模板、I μ I的正向引物Ρ2(20 μΜ)、1μ I的反向引物CDS III (20 μΜ)和IOyl的 2XPfu PCR Master Mix ;PCR条件为:94 C变性5min ;25个循环:94 C变性30s，58 C退火30s，72 C延伸lmin;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反应结束后，取5 μ 1，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
[0022]扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的DNA片段与测序载体PMD19-T Vecter连接，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5a感受态细胞。取100 μ I转化菌液均匀涂布在含有100 μ Ig/ml氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基平板上；表面晾干后，放在37 C恒温培养箱中倒置培养12-16 h。挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。
[0023](4)中华鳘cathelicidin的基因序列测定和结果:
编码其前体cathelicidin的基因由483个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为:
I atggagacct gcctgaaaat cctgctgctc gtcggggtgg tcacagcagc ccccacgtca
61 cccgcatctt ctctgccatc ccacgaggat gcgattttag cagcagtaca ggtgtacaac
121 caagagccag gcgtaacgct ggcctaccgg ctcctggaag cggagcctca gccagactgg
181 gacgtgactt cgaaaactgt ccagccgctg aaatttacta ttaaagagac agtgtgcctg
241 atctcggaga aacgcgacat caaccaatgc gatttcaaag aagacgggct gatcaaagac
301 tgctctggat tcttctccac tgaacaggac cccccctctg ccatgatcaa atgcgaggat
361 gcgtctgagg agcctgatat cgtcacccgg ggccgctggg ggagattcaa gaggagagcg
421 ggtaggttta ttcgcagaaa tcgctggcaa atcatttcga ctggtctcaa gctgattggc
481 tag
中华鳖cathelicidin编码区的cDNA核苷酸的序列表为:序列长度为483个碱基，序列类型:核酸，链数:单链，拓扑学:直链状，序列种类:cDNA，来源:中华鳖肝脏。
[0024]编码中华鳖cathelicidin抗微生物肽Ps- CATH4为第385到480位核苷酸，其氨
基酸序列为:苏氨酸L精氨酸2_甘氨酸3_精氨酸4_色氨酸5_甘氨酸6-精氨酸7_苯丙氨酸8_赖氨酸9_精氨酸I精氨酸&丙氨酸12_甘氨酸13_精氨酸14_苯丙氨酸15_异亮氨酸
16-精氨酸17_精氨酸18_天冬酰胺19_精氨酸2°_色氨酸21_谷酰胺22_异亮氨酸23_异亮氨酸24_丝氨酸25_苏氨酸26_甘氨酸27_亮氨酸28_赖氨酸29_亮氨酸3°_异亮氨酸31_甘氨酸
32
O
[0025]实施例2 PS-CATH4的化学制备方法:
(I)根据编码中华鳖cathelicidin基因推断的成熟肽Ps_CATH4氨基酸序列，用自动多肽合成仪(Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化,并确定其纯度大于97%。
[0026](2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。合成的PS-CATH4抗菌肽可以溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。
[0027]实施例3中华鳖抗微生物肽PS-CATH4的药理实验:
1.PS-CATH4抗菌活性检测:
将化学合成的PS-CATH4以2mg/ml的浓度溶解在无菌超纯水中；用接种环挑取新活化的微生物，然后均匀涂布在新的LB琼脂板上；将直径0.5 cm的圆形无菌滤纸片放在上述琼脂板上，然后向纸片上滴加10 μ I PS-CATH4样品溶液；放入37 ° C恒温培养箱中培养12-24h ;观察抑菌圈形成与否，将对PS-CATH4敏感的菌株记录下来。
[0028]2.Ps_CATH4 对敏感菌株最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)的测定
该实验以无菌液体LB作阴性对照，最小抑菌浓度的定义为肉眼可以观察到的完全抑制微生物生长的最低多肽浓度，或者是光吸收值不高于阴性对照5%的最低浓度。挑取新活化的微生物，接种至无菌液体 LB培养基，37° C恒温振荡器中200 rpm培养10_16h至对数生长期；用紫外分光光度计测菌液600 nm光波处的吸光值，吸光值为I时，浓度大约为109cfu/ml，将菌液用无菌液体LB培养基稀释至IO6 cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制浓度梯度为 200 μ g/ml>100 μ g/ml、50 μ g/ml>25 μ g/ml>12.5 μ g/ml、6.25 μ g/ml、
3.13 μ g/ml、1.56 μ g/ml、0.78 μ g/ml、0.39 μ g/ml、0.20 μ g/ml 的经 0.22 mm 孔径膜过滤的 Ps- CATH 4 样品溶液(即 51.112μΜ、25.556μΜ、12.778μΜ、6.389μΜ、3.194 μ Μ,
1.597 μ Μ、0.800 μ Μ、0.399 μ Μ、0.199 μ Μ、0.010 μ Μ、0.051 μ Μ),每孔 50 μ I ;每孔加入 50μ I上述稀释菌液；在恒温振荡器中37 °C,100 rpm振荡培养10-16h ;使用酶标仪测600 nm吸光值或肉眼观察；上述实验重复3次，取平均值。另取一块96孔板，同样操作，仅是每孔多加IOOmMNaCl，仍然重复3次，取平均值。
[0029]表1 PS-CATH4的最小抑菌浓度(MIC)