Ell基因及其表达产物的应用的制作方法[0002]肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于“根治性”治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓塞(TACE)已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。该方法可使90%以上的肝癌患者受益，但总体疗效有待提高。此外，经皮肝穿刺瘤内无水乙醇治疗(PEI)也是较常用的局部化疗方法，对癌直径<3cm的肝癌及门静脉癌栓的治疗有一定价值。但目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，因此，迫切需要寻找新的作用靶点，研究和开发肝癌特异的新药物，提高化疗的特异性和有效性。近几年来随着对肝癌基础研究的深入，生物治疗在肝癌的综合治疗中取得了较大进展，成了继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四大疗法，如免疫治疗、基因治疗，包括抗血管生成、自杀基因治疗、肿瘤疫苗治疗、siRNA技术等。但许多生物治疗的临床疗效仍不十分满意，且绝大多数还处在实验研究阶段，相关的关键理论和实验技术仍需进一步研究和发展。[0003]ELL(11_19赖氨酸富集白血病基因)是RNA聚合酶II转录延伸因子，通过阻止聚合酶转录时的暂停来增强转 录效率。首次发现是作为MLL的一个融合基因在急性髓样白血病的染色体倒位中发现的。有关ELL基因的研究文献报道较少，特别是ELL基因与肝癌的关系研究还未见文献报道。
[0004]本发明要解决的技术问题之一是提供一种ELL基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。[0005]本发明要解决的技术问题之二是提供一种ELL基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。[0006]本发明要解决的技术问题之三是提供一对特异扩增ELL基因的引物，该引物可用于制备用实时定量PCR诊断肝癌的产品。[0007]本发明要解决的技术问题之四是提供ELL基因特定编码DNA片段的测序引物，该测序引物可用于制备用DNA测序诊断肝癌的产品。
[0008]本发明要解决的技术问题之五是提供ELL基因的siRNAs，该siRNAs可用于制备治疗肝癌的药物。
[0009]外显子组测序是针对基因组中的蛋白质编码区，靶向富集外显子区域测序，以发现疾病相关遗传变异的技术。该技术近年越来越多地应用于发现人类基因组低频变异、鉴定单基因遗传病致病基因和肿瘤等复杂疾病易感基因研究，成为人类疾病相关变异研究的重要工具。为了鉴定肝癌发病过程中所发生体细胞突变的基因，本发明采用了外显子组测序技术分析了 10例伴有肝内门静脉癌栓的肝癌病人原位癌组织、门静脉癌栓组织及对应的癌旁组织。通过对高通量数据进行严谨的分析，过滤筛选出475个可靠的点突变。为了鉴定重要的肝癌相关基因，通过针对91个被Sanger测序方法验证具有突变的基因设计特异性siRNAs，在8株肝癌细胞株中筛选显著影响细胞生存的候选基因。ELL基因，延长因子RNA聚合酶II，为筛选出的肝癌细胞生存所必须的候选基因之一。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0011]在本发明的一方面，提供了一种ELL基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。
[0012]所述诊断肝癌的产品包括:用实时定量PCR诊断肝癌的产品、用DNA测序诊断肝癌的产品。
[0013]所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增ELL基因的引物。
[0014]所述用DNA测序诊断肝癌的产品包括:用于ELL基因特定编码序列的测序引物。
[0015]在本发明的另一方面，提供了一种用于制备用实时定量PCR诊断肝癌的产品中的一对特异扩增ELL基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID N0:9所示的序列或其互补序列，所述 引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO: 10所示的序列或其互补序列。
[0016]在本发明的另一方面，提供了一种用于制备用基因测序诊断肝癌的产品中的ELL基因特定编码序列的测序引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID N0:1所示的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO: 2所示的序列或其互补序列。
[0017]在本发明的另一方面，提供了一种ELL基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0018]所述治疗肝癌的药物包括:通过RNA干扰抑制ELL基因表达的双链核糖核酸、DNA载体、腺病毒或腺相关病毒载体，能够抑制ELL蛋白激酶活性的化合物、多肽、单克隆抗体。
[0019]其中，所述治疗肝癌的药物包括:通过RNA干扰特异性抑制ELL基因表达的双链核糖核酸及其不同修饰状态、不同递送方式。
[0020]所述治疗肝癌的药物包括:携带特异性针对ELL基因干扰其表达的DNA载体、病毒载体。
[0021]在本发明的另一方面，提供用于制备治疗肝癌药物的ELL基因的两对siRNAs，分别为ELL-sil和ELL-si2。其中，ELL-sil的正义链具有如SEQ ID NO:3所示序列，ELL-sil的反义链具有如SEQ ID NO:4所示序列。ELL-si2的正义链具有如SEQ ID NO:5所示序列，ELL-si2的反义链具有如SEQ ID NO:6所示序列。
[0022]本发明治疗肝癌的药物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。
[0023]本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。
[0024]在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对ELL蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人ELL基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人ELL蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的抗体包括可以阻抑ELL功能的抗体，也可以是不影响人ELL功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人ELL基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人ELL基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的ELL基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化ELL蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
[0025]本发明中，为了实现ELL基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用，SPELL基因及其表达产物作为肝癌诊断标志物应用的目的，本发明可通过如下技术方案实现: [0026](I)检测肝癌组织中ELL基因开放读码框(0RF)的核酸序列，其中，本发明中发现一例肝癌病人组织中ELL基因开放读码框(ORF)的核酸序列存在突变。
[0027](2)实时定量PCR检测ELL基因mRNA在肝癌病人癌组织及对应癌旁组织中的表达差异。
[0028]而对于ELL基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用，即ELL基因及其表达产物作为制备肝癌治疗药物的靶点，本发明可通过如下技术方案实现:
[0029](I)化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对ELL基因序列，利用脂质体包裹递送至肝癌细胞内，干扰ELL基因的表达，CCK-8法测量肝癌细胞Huh-7、Focus、MHCC-97H、HCC-LM3生长活性，本发明中实验结果证明特异性针对ELL基因的小核糖核酸分子能够抑制肝癌细胞体外的生长，说明ELL基因可用作制备肝癌治疗药物的靶基因；
[0030](2)利用各种载体,包括DNA载体、腺病毒、腺相关病毒载体来干扰ELL基因的表达，达到体内干扰ELL基因的效果，从而实现抑制肝癌细胞体内增殖的目的；
[0031](3)获得能够特异性抑制ELL基因蛋白产物的多肽、单克隆抗体，达到抑制ELL产物活性的目的，从而实现抑制肝癌细胞体内增殖的目的；
[0032]本发明中用于特异性干扰ELL基因的小核糖核酸序列设计原则如下:
[0033]I) GC 含量 30%_52% ；
[0034]2).sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U ;
[0035]3).不含有反向重复序列；
[0036]4).sense链的第19碱基为A ；
[0037]5).sense链的第3碱基为A ；
[0038]6).sense链的第10碱基为U ；
[0039]7).sense链的第19碱基不是G/C ；
[0040]8).sense链的第13碱基不是G。
[0041]本发明首次公开了 ELL基因及其表达产物的应用，并通过本发明的实验，首次证实ELL基因在肝癌病人发生错义突变(如图1所示)，并且通过ELL基因序列特异性siRNA干扰可以显著抑制肝癌细胞的生长，因此，ELL基因及其表达产物可作为诊断肝癌的标志物和用于肝癌治疗的药物靶点，使肝癌诊断更加准确、快速，并提供了新肝癌治疗的基因靶点。总之，本发明ELL基因及其表达产物为肝癌的防治提供了新的治疗靶点和有效新药。


[0042]下面结合附图与
[0043]图1是实施例2中ELL基因在一例肝癌病人癌旁组织、癌组织及门静脉癌栓样本中发生突变的测序峰图，结果显示该突变导致ELL蛋白第541位氨基酸的改变。
[0044]图2是实施例3中RNAi筛选技术体系示意图。
[0045]图3是实施例3中标准化的RNAi筛选总体情况示意图。
[0046]图4是实施例3中Z值与P值评估siRNA每株细胞活性的影响的统计学意义示意图。
[0047]图 5 是实施例 5 中实时定量PCR评价ELL-sil, ELL_si2在Huh-7、Focus、MHCC_97H、HCC-LM3细胞中的干扰效果示意图。
【具体实施方式】
[0048]以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0049]实施例1 10例肝癌病人的外显子组捕获测序
[0050]1.共30个组织样本(实验用组织来源于原发性肝癌并伴有门静脉转移的手术病人的癌旁组织、癌组织、门静脉癌栓组织)进行组织DNA抽提。采用德国QIAGEN公司的组织DNA抽提试剂盒，实验步骤按照产品说明书进行。抽提所得DNA经ND-1000分光光度计及0.8%的琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用。其中一例病人门静脉癌栓组织DNA降解，其余29个组织样本DNA质量符合要求。
[0051]2.Nimblegen外显子捕获，基因组DNA首先被随机打断成500bp左右的片段，随后在DNA片段两端分别连接上接头。经过PCR库检合格后的DNA片段与NimbleGen2.1M HumanExome Array芯片进行杂交。去除未与芯片结合的背景DNA后,将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来。这些DNA片段又随机连接成长DNA片段后，再次被随机打断并在其两端加上测序接头，经过LM-PCR的线性扩增，在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。
[0052]3.采用Illumina Genome Analyzer II测序系统进行测序。这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
[0053]4.ABI SOLiD 测序。测序所用试剂米用 SOLiD Fragment Library Core Kit(Applied Biosystems, 4464412)。按照 G3360-90001_SureSelect_S0LiD对基因组DNA进行片段化、末端修复、100-250bp片段选择、3’末端加腺苷酸、连接接头、前扩增、杂交、杂交后洗脱、后扩增等步骤，完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit+ 2.0Fluorometer仪器检测浓度，FlashGel Dock系统Lonza胶电泳或Agilent2100 Bioanalyzer检测文库的大小和纯度。质控标准:构建文库浓度不低于Ing/ μ L ；电泳观察构建的文库大小~260bp。按照SOLiD ? EZ Bead? Emulsifier (4441486B, AB)，SOLiD? EZ Bead? Amplifier (4443494B,AB), SOLiD? EZ Bead? Enricher (4443496B，AB)相应程序，在自动化 EZ 系统上完成Emulsion PCR0 按照 Applied Biosystems 5500 Series Genetic Analyzers User Guide(4456991E)准备测序试剂,将铺好beads的Flowchip上机,选用Fragment程序,进行单向lX75bp测序。测序过程由ABI提供的Instrument Control Software进行控制，并可实时观测每个连接反应。
[0054]5.基本数据分析，包括:数据产出统计:对测序结果进行图像识别(Basecalling),去除污染及接头序列；统计结果包括:测定的序列(Reads)长度、Reads数量、 数
据产量。
[0055]6.高级数据分析，包括:(l)Clean reads序列与参考基因组序列比对；(2)目标外显子区域测序深度分析；(3)目标外显子区域一致序列组装；(4)目标外显子区域SNP检测及在CXDS数据库中的注释；(5)可变剪切、基因融合、外显子融合分析。
[0056]实施例2在肝癌病人组织中对ELL基因特定编码序列进行测序
[0057]1、肝癌组织DNA的抽提
[0058]采用QIAGEN 公司 DNA 抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit, Cat.n0.:51306)进行相关抽提操作，具体见该产品说明书，操作步骤简述如下:
[0059](I)将组织放置于碾钵中，加入适量液氮充分碾磨至粉末状，将组织粉末转移到1.5ml的离心管中(约25mg)，在离心管中加入100 μ I裂解液和10 μ LRNaseA/蛋白酶K贮液，迅速充分振荡混匀，置于55°C温浴15分钟，其间来回颠倒离心管数次。
[0060](2)加入 10μ L3MNaAc (ρΗ4.8)，然后加入 250 μ L DNA Binding Solution，充分振荡混匀，使溶液呈水溶液状，随后将其转移到离心吸附柱中。混匀后将上清直接加入到离心吸附柱中(切勿将沉淀杂质取到)，放置一分钟，12000rpm离心30秒钟。
[0061](3)倒掉收集管中的废液,再加入600 μ Lffash Buffer, 12，OOOrpm离心30秒。
[0062](4)重复步骤3—次至两次。此步骤中，最后一次清洗应于12，OOOrpm离心3分钟，以充分除去Wash Buffer。
[0063](5)小心取出吸附柱(勿沾上Wash Buffer，因为乙醇会影响后续的反应)，将其放入一个干净的1.5ml离心管中，并加入50 μ LDP洗脱液或水(DP洗脱液一定要加在吸附柱的正中)。放置2分钟后，于12，OOOrpm离心I分钟。离心管中便是所提取的基因组DNA。取3-5 μ L电泳。如有残余RNA，可适当加入少量RNaseA。
[0064]2、DNA 测序
[0065]DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP (标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差I个碱基的3’末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的COXcharge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR (定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
[0066]用前向引物:GGGGCTCTACCTCATACTCCT(SEQ ID NO:1)，反向引物:
[0067]AGGGAATCACCCGAGAGG(SEQ ID NO:2)分别从待检测的肝癌组织及相应癌旁组织DNA中扩增出DNA片段，米用高保真性DNA聚合酶Hotstar (QIAGEN, HotStar HiFidelityPolymerase Kit, Cat.n0.:202605)。
[0068]50 μ LPCR反应体系如下:DNA模板I μ L，前向引物(F) 0.5 μ L，反向引物(F)0.5 μ L，Hotstar DNA 聚合酶 0.1 μ L, dNTP (IOmM) 0.5 μ L, Mgcl2 (2.5mM) I μ L,补足 ddH20 至50 μ L体积ο
[0069]PCR反应条件如下:95°C热启动5分钟，95 °C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，35~40循环。结果如图1所示，在其中一例肝癌病人的癌组织中发现突变位点(C — G)，结果显示该突变导致ELL蛋白第541位氨基酸的改变。
[0070]实施例3 RNAi筛 选肝癌细胞生长必需突变基因
[0071]RNAi作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术，具有明显的优点，它比反义核酸技术优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景。具体可用于以下几个方面:基因功能分析；研究信号传导通路的新途径；新药物的研究和开发；基因治疗。RNAi只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用引起的副作用。肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默的效应，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时沉默。
[0072]CCK-8测定细胞活性:CCK_8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含WST-8[其化学名称为:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4- 二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料(Formazan dye)。细胞增殖越多越快,则颜色越深；细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。分光光度计读数，产生原始细胞活性数据，实验流程如图2所示。原始数据经过标准化，数据校正、Z值评估等步骤，8个肝癌细胞株 Huh-7, PLC/PRF/5, Focus, WRL68, MHCC-97L, MHCC-97H, HCC-LM3 and HCC-LM6 被用来进行细胞活性分析。原始数据经过标准化，数据校正、Z值评估等步骤，每株细胞系在RNAi之后的总体生长活性状况如图3所示:在WRL68、PLC/PRF/5、HCC-LM3、HCC-LM6四株细胞系中多数基因被干扰之后对细胞活性无显著影响(单样本T检验，WRL68，P=0.0801 ；PLC/PRF/5, P=0.3028 ；HCC-LM3, P=0.1617 ；HCC-LM6, P=0.5181)。然而，在 Focus、Huh-7,MHCC-97L、MHCC-97H四株细胞中这些基因的功能缺失对细胞活性有显著影响(单样本T检验，Focus, P=0.0111 ；Huh-7, P=0.0001 ；MHCC-97L, P=0.0013 ；MHCC-97H, P=0.0436)。接下来为了从这些筛选数据中鉴定出有效siRNAs，每条siRNA对细胞活性影响的表型由相应统计学参数Z值与P值来进行评估。结果如图4所示，Z〈-5，P〈0.01范围内的siRNAs促进细胞活性，Z>5，P〈0.01范围内的siRNAs抑制细胞活性。得到siRNA库对肝癌细胞生长影响的数据(见图3-4)。实验结果表明特异性干扰ELL基因表达的小干扰核糖核酸(siRNA)能够抑制肝癌细胞Huh-7、FoCus、MHCC-97H和HCC-LM3的生长，肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明ELL基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。
[0073]实施例4 ELL基因的小干扰核糖核酸(siRNA)
[0074]体外化学合成小干扰核糖核酸(siRNA)具有快速、简单和特异性强等特点，在抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景。针对ELL基因mRNA设计合成2对条siRNAs对应靶序列，该2对siRNA序列分别如下:
[0075]ELL-sil 正义链:GAGGCCAUCUAUCCGAUUUdCdA (SEQ ID N0:3)；
[0076]ELL-sil 反义链:AAAUCGGAUAGAUGGCCUCdAdG (SEQ ID N0:4)；
[0077]ELL-si2 正义链:GCAGCAUACAGGACAAGAUdCdA (SEQ ID N0:5)；
[0078]ELL-si2 反义链:AUCUUGUCCUGUAUGCUGCdCdC (SEQ ID N0:6)；
[0079]另外设计无关序列作为阴性对照siRNA:
[0080]正义链，5，-UUCUC CGAACGUGUCACGUdTdT-3，(SEQID NO: 7)
[0081]反义链，5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3，(SEQID NO:8)
[0082]在96 孔板中每孔接种 3 X IO3 个 Huh_7、Focus、MHCC-97H 和 HCC-LM3 细胞(无血清培养液)(均源自中国科学院细胞库)，待细胞密度达到40%左右时，利用脂质体(Lipofectamine2000)转染试剂分别将上述2种siRNA按终浓度50nmol/L转染进Huh_7、Focus、MHCC-97H和HCC-LM3细胞中，4h后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24h为I个检测单位培养7d，每天检测I次该细胞密度。每孔待测细胞液中加10 μ L CCK-8，37°C孵育lh。利用酶标仪在450nm波长下检测其吸光度以代表细胞存活能力，绘制生长曲线。
[0083]实施例5实时定量PCR评价ELL基因在肝癌细胞中RNAi干扰效果
[0084]采用相对定量法检测ELL基因在肝癌样本中的表达差异(Thermal Cycler DiceTMReal Time System TP800, Takara; SYBR? Premix Ex TaqTM, Takara)。突光定量 PCR(real-time PCR)
[0085]反应体系如下:总体积20 μ L, SYBR Premix Ex TaqlO μ L,上下游引物(10 μ mol/L)各0.4 μ L，cDNAl μ L, ddH208.2 μ L,混匀试剂，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。反应条件为95°C变性5秒，68°C退火延伸30秒，40循环。仪器使用按厂家的说明操作。管家基因β-actin作为内参。
[0086]ELL-F:5，-GAGGATAGGAGCTACGGGCT-3，(SEQ ID NO:9)，
[0087]ELL-R:5，-TCGGATAGATGGCCTCAGTG-3’ (SEQ ID NO: 10);
[0088]e-actin-F:5’ -AATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 11)，
[0089]e-actin-R:5’ -ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT-3’ (SEQ ID NO: 12)。
[0090]实时定量PCR检测表明，ELL基因在Huh-7、Focus、MHCC_97H和HCC-LM3细胞中被ELL-sil, ELL-si2有效干扰而表达下调(实验结果见图5)。