专利名称：一种复配纤维素酶提高其降解木质纤维素效率的方法目前，利用植物纤维材料生产燃料乙醇的可能性问题，早已引起世界各国科学家和政府重视，欧洲、美国的一些试验机构已对此进行了多年研究。发展用木质纤维素生产燃料乙醇，是发展绿色可再生能源创出新路和减少有害气体排放保护环境的需要。在普遍的农作物中，纤维素约占其干重的45%左右。纤维素分子是由葡萄糖分子通过β - (1，4)糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，基本重复单位是纤维二糖，是地球上最丰富的生物聚合物。天然纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30% 80%之间。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成致密的纤维丝，包埋在半纤维素和木质素形成的保护层里，形成网状结构。如需将纤维素转化为乙醇，就必须先将它降解为葡萄糖。尽管纤维素化学结构较简单，但由于其来源的多样性、存在形式的复杂性以及其相关特征如大小、形状、多孔结构、表面积、与非纤维素组分的关系等，都能影响到纤维素酶对纤维素的降解过程，因此，天然纤维素极难被大多数微生物降解从而转化为本身需要的碳源。研究纤维素酶解时，通常用羧甲基纤维素和结晶纤维素(如来自漂白的商品化木浆)作分析底物，前者一般用作内切酶研究的底物；后者结晶程度较高，通常用作外切酶研究的底物。木质纤维素可以被纤维素酶降解为可发酵糖，并能作为多种微生物代谢的能源物质，在生物工程领域可以得到广泛运用。用纤维素酶降解木质纤维素具有设备简单、反应条件温和、副产物少、无污染等优点。但目前的酶解工艺仍然存在酶解效率低、可发酵糖浓度低、纤维素酶成本高等问题。在纤维素酶糖化工艺中，降低纤维素酶的成本并提高其葡萄糖转化率是该工艺能否过关的关键因素，所以通常通过复配来提高纤维素酶降解木质纤维素效率并减少纤维素酶的用量使其得以实现。国际上关于复配纤维素酶的研究已取得一定进展，如利用植物延展素在不水解多糖的情况下，有效的破坏木质纤维素中多糖链之间形成的氢键网络，进而破坏其有序、致密的结构，使木质纤维素的糖链变得疏松膨胀，从而易于被酶水解。
本发明提供一种提高木质纤维素酶解效率的方法，解决了现有酶解工艺仍然存在酶解效率低、可发酵糖浓度低、纤维素酶成本高等问题本发明还提供了用多种物质协同纤维素酶提高木质纤维素酶解效率的工艺，操作工艺简单适用于工业化生产。本发明提供的提高木质纤维素酶解效率的方法，其步骤包括1)将水洗处理后的木质纤维素分散于缓冲液中，实际纤维素添加量为总体系的1% 6% ；所述的缓冲液为柠檬酸或柠檬酸钠缓冲液pH为4. 5^5. 5，加量为总体系的2. 59TlO% (v/w)，补足水至40g，将pH调至4. 5 5.5 ；2)向步骤1)中添加 Tween-80 0. 025%。 500%。(v/w)或 PEG-6000 0. 010%。 300%。(w/ w)，和牛血清白蛋白0. 010%。 200%。(w/w)，以降低木质素对纤维素酶的无效吸附；3)反应Γ2小时后，向步骤2)中添加硫代硫酸钠0.025% 0. 500%(w/w)；每克纤维素添加β -葡萄糖苷酶0. 5IU 500IU、木聚糖酶5IU 100IU、果胶酶0. OlIU 2IU ；纤维素酶 lFPU/g 100FPU/g纤维素.于45°C 55 °C下酶解；
所述的木质纤维素选自麦秸、玉米秸秆、高粱秸、芦苇、稻草、木屑或竹粉。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测量溶液中的葡萄糖量，当纤维素酶用量为15FPU/g纤维素时，木质纤维素酶解后的葡萄糖转化率较对照提高了 46%。本发明的积极效果在于复配纤维素酶解决了传统酶解工艺存在的酶解效率低、 可发酵糖浓度低、纤维素酶成本高问题，木质纤维素酶解后的葡萄糖转化率提高了 46%，为木质纤维素生产燃料乙醇提供了技术支撑。

取气爆秸秆16. Mg，加入PH4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g;加入浓度为 10%(v/v) Tween-80 50 μ 1 禾口 l%(w/v)牛血清白蛋白 100 μ 1 :反应 1. 5 小时后，加入 2IU/g 纤维素的β-葡萄糖苷酶、36IU/g纤维素的木聚糖酶、0. lMIU/g纤维素的果胶酶、10%(w/ ν)硫代硫酸钠300 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为40%。实施例2
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入4IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、45IU/g纤维素的木聚糖酶、0. lMIU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠300 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为42%。实施例3
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入5IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、45IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠400 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为41%。
实施例4
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、63IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠600 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。.
反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为40%。实施例5
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、72IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠200 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为42%。实施例6
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、54IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠500 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为46%。实施例7
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液2ml，补水至40g ；加入浓度为10% (w/ ν) PEG-6000 105 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、54IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠500 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为45%。实施例8
取气爆芦苇碎屑15. 71g，加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；加入浓度为 10%(v/v) Tween-80 50 μ 1 禾口 l%(w/v)牛血清白蛋白 100 μ 1 :反应 1. 5 小时后，加入 3IU/g 纤维素的β-葡萄糖苷酶、54IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/ ν)硫代硫酸钠500 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为42%。实施例9
取气爆竹粉13. 78g，加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液^iil，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、54IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠500 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为40%。实施例10
取气爆木屑17. 47g，加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液^iil，补水至40g ；加入浓度为10% (ν/ ν) Tween-80 50 μ 1和l%(w/v)牛血清白蛋白100 μ 1 反应1. 5小时后，加入3IU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶、54IU/g纤维素的木聚糖酶、0. 108IU/g纤维素的果胶酶、10%(w/v)硫代硫酸钠500 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到葡萄糖转化率增加量为41%。以下试验为本发明方法与单因素复配方法的葡萄糖转化率的比较 试验例1
取气爆秸秆16. Mg，加入PH4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；分别添加除菌β -葡萄糖苷酶 0IU,0. 5IU、1. 0IU、1. 5IU、2. 0IU、2. 5IU、3. 0IU、3. 5IU、4. 0IU、4. 5IU /g 纤维素和 15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当葡萄糖苷酶添加量为3IU/g纤维素时，葡萄糖转化率增加量为26%。试验例2
取气爆秸秆16. Mg，加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；分别添加除菌木聚糖酶 0IU、9IU、18IU、27IU、36IU、45IU、MIU、63IU、72IU/g 纤维素和 15FPU/g 纤维素的纤维素酶，50°C下酶解。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当木聚糖酶添加量为MIU/g纤维素时，葡萄糖转化率增加量为4%。试验例3
取气爆秸秆16. Mg，加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；分别添加除菌果胶酶 0IU,0. 032IU、0. 064IU、0. 096IU、0. 128IU、0. 160IU、0. 192IU、0. 224IU、0. 256IU/g 纤维素和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解，48小时。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当果胶酶添加量为0. 128IU /g纤维素时，葡萄糖转化率增加量为10%。试验例4
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液^il,补水至40g ；分别添加除菌的浓度为 10% (w/ν) PEG-6000 0 μ 1、15 μ 1、30 μ 1、45 μ 1、60 μ 1、75 μ 1、90 μ 1、105 μ 1 和
15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当 10%PEG-6000添加量为105 μ 1时，葡萄糖转化率增加量为18%。试验例5
取气爆秸秆16. Mg，加入ρΗ4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；分别添加除菌的浓度为 10% (v/v) tween-80 0μ 1、10μ 1、20μ 1、30μ 1、40μ 1、50μ 1、60μ 1、70μ 1、80μ 1 禾口
15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解。
反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当 10%tween-80添加量为50 μ 1时，葡萄糖转化率增加量为16%。试验例6
取气爆秸秆16. 54g,加入pH4. 8的柠檬酸缓冲液^il,补水至40g ；分别添加除菌的浓度为 10%(w/v)硫代硫酸钠 Ομ 1、200μ 1、250μ 1、300μ 1、350μ 1,400 μ 1,450 μ 1、 500μ 1、550μ 1、600μ 1禾口 15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当10%硫代硫酸钠添加量为500 μ 1时，葡萄糖转化率增加量为19%。试验例7
取气爆秸秆16. Mg，加入ρΗ4. 8的柠檬酸缓冲液anl，补水至40g ；分别添加除菌的浓度为 l%(w/v)牛血清白蛋白 Ομ 1、20μ 1、40μ 1、60μ 1、80μ 1、100μ 1、120μ 1、140μ 1、 160 μ 1,180 μ 1和15FPU/g纤维素的纤维素酶，50°C下酶解。反应结束后，离心取上清，用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，得到当1%牛血清白蛋白添加量为100 μ 1时，葡萄糖转化率增加量为13%。⑴实验器材
96孔板、水浴摇床、酶标仪、ρΗ计、三角瓶、移液枪、封口膜、EP管、0. 22 μ m滤膜
⑵实验过程
对用单一复配物质协同纤维素酶提高木质纤维素酶解效率的结果(试验例1-7)与经优化过的用多种复配物质协同纤维素酶提高木质纤维素酶解效率的结果(实施例1-9)进行比较。


本发明提供一种提高木质纤维素酶解效率的方法，通过用多种物质协同纤维素酶提高木质纤维素酶解效率，解决了传统酶解工艺存在的酶解效率低、可发酵糖浓度低、纤维素酶成本高问题，木质纤维素酶解后的葡萄糖转化率提高了46%，为木质纤维素生产燃料乙醇提供了技术支撑。