专利名称：一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法在畜牧业上利用体外受精技术能以工厂化的形式批量生产试管胚胎，从而为家畜胚胎移植提供更多的高质量的胚胎，促进家畜良种化。体外受精技术主要包含卵母细胞体外成熟、精子获能受精、胚胎体外培养三个环节。对于哺乳动物卵母细胞而言，高浓度的环磷酸腺苷(cAMP)能使减数分裂受到抑制，从而抑制卵母细胞的核成熟，为细胞核和细胞质同步成熟创造时间，进而能提高卵母细胞成熟质量。FSK能刺激腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase)的活性,从而升高细胞内的cAMP水平。IBMX和CIL都属于磷酸二酯酶抑制剂，它们通过减少cAMP的降解来提高cAMP浓度。文献检索披露1.Biology of reproduction, 65 (2001), 1444 - 1451,作者:FJ Richard等发表的《3A型磷酸二酯酶在鼠卵母细胞成熟中的作用》，通过对不同阶段卵母细胞检测，研究了 3A型磷酸二酯酶在鼠卵母细胞中的性质和表达规律。2. MolecularReproduction and Development, 70, 3 (2005) , 361-372,作者MF Laforest 等发表的《特异性磷酸二酯酶对猪卵母细胞自发减数分裂恢复控制的重要意义》研究中得出，CIL和IBMX能可逆性地阻滞减数分裂的恢复。3. Human Reproduction, 23, 3 (2008)，504-513，作者Yi-min Shu等发表的《cilostamide和forskolin对人未成熟卵母细胞减数分裂的恢复和胚胎发育的影响》中指出，联合使用CIL和FSK能通过阻止缝隙连接通讯丢失和恢复减数分裂的协同效应，影响人卵母细胞的发育能力。4. Human Reproduction, 25，12 (2010),2999-3011，作者F. K. Albuz等发表的《卵母细胞成熟的生理模型一种能显著提高胚胎生产和妊娠结果的新的体外成熟系统》文章，得出，成熟前的牛、鼠卵母细胞使用SPOM系统，能增加卵母细胞-卵丘细胞复合体间的缝隙连接，减缓减数分裂进程，能显著提高牛卵母细胞体外受精囊胚率和囊胚质量，显著提高小鼠囊胚率、移植受胎率和胎儿出生率。国内有1999年7卷3期《农业生物技术》上陈勇等人发表的《Forskolin对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟及卵丘扩展的影响》、2007年12卷5期《中国农业大学学报》上卜淑敏等人发表的《3种磷酸二醋酶对小鼠卵母细胞自发成熟的影响》等等。上述已有方法用于牛和鼠、猪，但很少有用于提高绵羊卵母细胞发育能力的报道。本发明以此为切入点，展开的研究方法具有科学性与实践性。
本发明的目的在于使用三种试剂促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，能显著提高体外受精效率，将该方法用于良种繁育，将缩短育种时代间隔，显著降低生产成本。本发明的目的是这样实现的一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，采用腺苷酸环化酶激活剂，即为FSK，磷酸二酯酶抑制剂，即为CIL，3-异丁基-I-甲基黄嘌呤，即为IBMX,联合对绵羊卵母细胞进行处理，提高其体外发育能力，其步骤为 其I摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其生理盐水清洗3-4次；吸有Iml加有100μ Mol/L的FSK和500 μ Mol/L IBMX的抽卵液，带有9号针头的IOml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35_60mm的皿内； 其2在显微镜下捡出卵母细胞，放置在抽卵液中2小时，用含有20 μ Mol/L CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO2箱，在5% CO2,95%空气、温度为38. 6°C条件下培养2小时；再用 不含CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO2箱培养22-24小时；用体外受精液洗涤2_4次，按25-30枚/滴的密度加入2小时前平衡好的50-70 μ I的体外受精液滴内； 其3用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有体外受精液的试管内，放入CO2箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速，离心4-5分钟弃去上清液，按2_4X IO6个/ml的密度加入体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育； 其4将受精22-24小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μ I/孔的体外培养液的四孔培养板内培养，24小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率；将囊胚放在Hochest33342中平衡10分钟，载玻片上压片，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数； 其中实验液体的配制
抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0· 7 mg / ml 肝素钠+100 μ Mol/L FSK+500 μ Mol/L IBMX ；
含 CIL 的体外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙丽酸纳 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+20 μ Mol/LCIL +100IU/ml 青霉素 +100IU/ml 链霉素；
不含 CIL 的体外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙丽酸纳 +0. ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 青霉素+100IU/ml链霉素；
SOF 6.29mg/ml NaCL +0. 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸钠+0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸钠 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 ；
体外受精液S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；
体外培养液S0F+3mg/mlBSA。所述的方法，所用腺苷酸环化酶激活剂，磷酸二酯酶抑制剂，3-异丁基-I-甲基黄嘌呤，Hochest33342为SIGMA公司生产。本发明采用三种试剂促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，将绵羊卵母细胞放在含有FSK和IBMX的抽卵液内2小时，用含有CIL的体外成熟液培养2_4小时，再用不含有CIL的体外成熟液培养22-24小时,与精子结合实施体外受精,24小时后置于体外培养液中培养，48小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率和囊胚细胞数；彰显技术进步。

实施例摘取宰杀30分钟内的绵羊卵巢，置入温度在30°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗4次；在吸有Iml加有100μ Mol/L的FSK和500 μ Mol/L IBMX的抽卵液，带有9号针头的IOml注射器抽吸卵巢表面6mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在60_的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放置在抽卵液中2小时，用含有20 μ Mol/L CIL的体外成熟液洗涤3次，在CO2箱内培养2小时，CO2箱的气象条件为5% C02，95%空气，温度为38. 6°C。再用不含CIL的体外成熟液洗涤3次，CO2箱内培养24小时，用体外受精液洗涤4次，按30枚/滴的密度加入2小时前平衡好的70 μ I的体外受:精液滴内；用水浴解冻精液，移入2小时如平衡好的装有体外受:精液的试管内，放入CO2箱，上游25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心5分钟弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按4Χ IO6个/ml的密度加入体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育；将受精24小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤4次，按70枚/孔的密度移入平衡好的500 μ I/孔体外培养液的四孔培养板内培养；24小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率；将囊胚放在Hochest33342中平衡10分钟，载玻片上压片，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数。其中实验液体的配置
抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0. 7 mg / ml 肝素钠+100 μ Mol/L FSK+500 μ Mol/L IBMX ；
含 CIL 的体外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH 十I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙丽酸纳+0. ImM/L 半月光氛酸+10ng/ml EGF+20 μ Mol/L CIL+100IU/ml 青霉素 +100IU/ml 链霉素；
不含 CIL 的体外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙丽酸纳 +0. ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 青霉素+100IU/ml链霉素；
SOF 6.29mg/ml NaCL +0. 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸钠+0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸钠 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 ；
体外受精液S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；
体外培养液S0F+3mg/mlBSA。本发明的联合制剂实验组与对照组使用结果验证见下表。
WW I卵裂率I囊胚率I囊胚细胞数
实验组 73·73±5·96Α 41. 24±2· 33Α 187. 17±36· 00a 对照组 |54· 74±6· 78B |33·84±2·87Β | 25· 70±25· 94b _由上表得知，将FSK、IBMX和CIL相结合，体外受精后的囊胚率和囊胚细胞数显著高于没有使用这三种试剂的对照组。试验所用腺苷酸环化酶激活剂Forskolin，即为FSK ;磷酸二酯酶抑制剂cilostamide,即为 CIL ;3_ 异丁基-I-甲基黄嘌 3-isobutyl-l-methy lxanthine,即为、IBMX ；Hochest33342 ;TCM199_h印es、PVA、肝素钠、TCM199_HC03、FBS, FSH、LH EGF, BSA 皆为SIGMA公司生产。青霉素为江西省科大动物药业有限公司生产，链霉素为陕西骊祥动物药业有限公司生产，庆大霉素为郑州羚锐制药有限公司生产。·


本发明提供的一种促进绵羊卵母细胞体外发育的方法，采用腺苷酸环化酶激活剂，即为FSK，磷酸二酯酶抑制剂，即为CIL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，即为IBMX，联合对绵羊卵母细胞进行处理，提高其体外发育能力；具体步骤摘取宰杀绵羊卵巢，置入生理盐水中清洗3-4次；吸有1ml加有100μmol/L的FSK和500μmol/LIBMX的抽卵液，带有9号针头的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在35-60mm的皿内；在显微镜下捡出卵母细胞，放置在抽卵液中，用含有20μmol/LCIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO2箱培养；再用不含CIL的体外成熟液洗涤3次，置于CO2箱培养，加入体外受精液滴内;用水浴解冻精液，与卵母细胞共同孵育；24小时后统计卵裂率，168小时后统计囊胚率。