专利名称：一种新型天然黑色素的生产方法一种新型天然黑色素的生产方法技术领域本发明属于由微生物液态发酵生产黑色素技术领域，具体涉及一株出芽短梗霉菌株及采用改换培养基液态发酵提高黑色素产量的方法。黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，它是通过多羟基酚(极易结合蛋白)氧化而形成结构不规则的非均质的类多酚聚合体。黑色素在工农业上，可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、阳离子螯和剂、作为无定形的半导体以及生物杀虫剂的光保护剂；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病、一些可溶性黑色素在体外具有抑制爱滋病病毒感染宿主细胞的作用，因此有可能成为一种有效的药物.目前黑色素的生产多是通过化学合成或从动、植物体进行提取。化学合成黑色素反应过程多，且具有一定的毒害性；从动、植物体提取黑色素存在样品来源的问题。利用微生物生产黑色素具有反应条件温和、成本低、操作简单、无需大量的样品等优点。而国内利用真菌发酵生产黑色素的研究还很少，而本发明是利用出芽短梗霉发酵产生黑色素。发明内容本发明的目的是提供一株产黑色素的出芽短梗霉菌(AurecAasidium Pullulans)，并采用改良培养基对其深层液态发酵提供黑色素产量的方法。一种由出芽短梗霉菌深层液态发酵生产黑色素的方法，其特征在于先将出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans)菌株活化4 8小时，摇瓶培养12 36小时，按发酵培养基体积的1 10%接种于发酵培养基，进行液态发酵。发酵得到的发酵液在5000r/min 的条件下离心5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。采用的实施步骤如下(1)菌种活化将保藏在PDA斜面上的菌种，在22 下恒温培养4 8小时， 得到活化菌株；(2)制备种子培养基，其组成为(g/L)葡萄糖20 40，土豆汁100 700，牛肉膏 1 5，蒸馏水，pH 4 7，121 °C灭菌20min ；从斜面上挑取一环出芽短梗霉菌接入上面的种子培养基中摇瓶培养，培养12h 36h，培养温度27士2°〇，转速为150 230r/min。(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖100，丁二酸铵 3，丁二酸 2，K2C03 0. 3, KH2PO4O. LMgSO4. 7H20 0. 1，ZnSO4. 7H20 5 X 1(Γ5，玉米浸出液 0· 5， PH 4. 5 5.0。121°C高压蒸汽灭菌20min;或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为 (g/L)葡萄糖40 80，土豆汁400 800，牛肉膏1 5，FeSO4O. 02 0. 05，蒸馏水，pH 4 7，121°C灭菌 20min。(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为1 % 10 % (V/V)，发酵搅拌速度为 200 500r/min，发酵温度为25°C，通气量为0. 5 1(V/V)，罐压为0. 01 0. 02Mpa, pH 4. 0 7. 0，分别发酵3 5天。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液。
本发明菌株保藏编号为CGMCC No 3337。见天津科技大学申请专利，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β -聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法，


实施例1
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在25°C恒温培养4小时，得到活化菌株；
(2)取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌 20min ；摇瓶于25°C，转速为200r/min的摇床上培养Mh，作为种子液；
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L):葡萄糖100，丁二酸铵 3，丁二酸 2，K2CO3 0. 3，KH2PO4 0. 1，MgSO4. 7H20 0. 1，ZnSO4. 7H20 5X 1(Γ5，玉米浸出液 0. 5，pH 4. 5 5. 0。121°C高压蒸汽灭菌20min ；或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖40，土豆汁400，牛肉膏l，FeS040 . 02，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌20min。
(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为(V/V)，发酵搅拌速度为200r/min， 发酵温度为250C，通气量为0. 5 (V/V)，罐压为0. OlMpa, pH 4.0,分别发酵7天和3天后， 发酵液5000r/min，离心5min，取上清液；发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心 5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用50%的甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用 lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得2. 47g/L和8. 79g/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 2. 57倍。
实施例2:
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在25°C下恒温培养6小时，得到活化菌株；
(2)取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子4培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏1，蒸馏水，pH 4，121°C灭菌 20min ；摇瓶于25°C，转速为200r/min的摇床上培养Mh，作为种子液；
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖100，丁二酸铵 3，丁二酸 2，K2CO3O. 3，KH2PO4O. 1，MgSO4. 7Η200· 1，ZnSO4. 7Η205 X 1(Γ5，玉米浸出液 0. 5，pH 4. 5 5.0。121°C高压蒸汽灭菌20min;或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/ L)葡萄糖80，土豆汁800，牛肉膏5，FeSO4O. 05，蒸馏水，pH 7，121°C灭菌20min。
(4)将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基状液量和本发明提出的发酵培养基，装液量为7L，接种量为10% (V/V)，发酵搅拌速度为 500r/min,发酵温度为25°C，通气量为1 (V/V)，罐压为0. OlMpa, pH 4. 0，分别发酵7天和4 天，发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以6mol/L盐酸酸解， 后用50%甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。 最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得2. 56g/L和10. 74g/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 3. 19倍。
实施例3
(1)菌种活化将保藏在PDA培养基斜面上的菌种，在25°C下恒温培养6小时，得到活化菌株；
(2)取一环出芽短梗霉菌种接入装有50毫升培养基的500毫升挡板瓶中。种子培养基的水溶液组成为(g/L):葡萄糖20，土豆汁100，牛肉膏3，蒸馏水，pH 4.5，121°C灭菌 20min ；摇瓶于25°C，转速为200r/min的摇床上培养Mh，作为种子液；
(3)发酵培养基现有的发酵培养基，其水溶液组成为(g/L)葡萄糖100，丁二酸铵 3，丁二酸 2，K2CO3O. 3，KH2PO4O. 1，MgSO4. 7Η200· 1，ZnSO4. 7Η205 X 1(Γ5，玉米浸出液 0. 5，pH 4. 5 5.0。121°C高压蒸汽灭菌20min;或本发明提出的发酵培养基，其水溶液组成为(g/ L)葡萄糖 60，土豆汁600，牛肉膏3，FeSO4O. 02，蒸馏水，pH 4. 5，121°C灭菌 20min。(4) 将种子液接种于IOL自动控制发酵罐中，发酵培养基分别为现有发酵培养基和本发明的提出发酵培养基，装液量为7L，接种量为6% (V/V)，发酵搅拌速度为300r/min，发酵温度为 250C，通气量为0. 8 (V/V)，罐压为0. OlMpa, pH 4. 5，分别发酵7天和5天后，发酵液5000" min,离心5min，取上清液；发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用50%甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用lmol/L碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用3mol/L盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。
(5)发酵液经上述处理后，分别获得2. 47g/L和9. 18g/L的黑色素，采用本发明的发酵培养基，黑色素的产量提高了 2. 71倍。


本发明公开了一种新型天然黑色素的生产方法，特征是将出芽短梗霉菌活化4～8小时，然后摇瓶培养12～36小时得到的种子液，按发酵培养基体积的1～10％接种于发酵培养基，进行液态发酵。发酵得到的发酵液在5000r/min的条件下离心5min，所得上清液先以盐酸酸解，后用甲醇进行沉淀，得黑色素粗品。上述粗品用碱性溶液溶解得到黑色溶液。最后用盐酸对所得黑色溶液进行沉淀，即得到黑色素。与其他发酵培养基相比，采用本发明的培养基，黑色素产量由2.47g/L提高到10.74g/L，发酵周期由7天缩短为3天，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本。

公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日